[发明专利]全基因组沉默子筛选系统及其应用

说明书

本发明公开了一种全基因组沉默子筛选系统，该系统包括MAS‑seq载体，该MAS‑seq载体包括强启动子、同源臂、标记基因、poly A位点，该MAS‑seq载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。该MAS‑seq载体在同源臂间插入沉默子序列时，可以大大降低标记基因mRNA的表达丰度，通过测序检测标记基因mRNA的表达量，表达量低的即表明插入序列为沉默子序列。由此可以用于大规模筛选基因组沉默子，该系统灵敏，且操作便捷，可大规模使用和广泛应用。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种全基因组沉默子筛选系统及其应用。

背景技术

人类基因组中有超过98%都属于非编码序列：包括重复区域，非编码RNA区域，基因内含子区域等。DNA百科全书项目（ENCODE）项目利用表观遗传特征和转录因子结合位点对这些区域进行了注释，是一件很有意义的工作。近年来人们发现这些区域存在着一些重要的调控元件：如启动子、增强子、绝缘子以及沉默子，而这些调控元件被证实在基因表达，生物表型以及疾病发生方面具有重要作用。但是目前对非编码序列的研究主要集中在启动子、增强子和绝缘子，还未有任何技术可以在全基因组水平筛选出沉默子，从而限制了对沉默子的研究和应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种全基因组沉默子筛选系统（MAS-seq），通过该系统能够在全基因组水平筛选出沉默子，且该系统灵敏度高，可以用于任何物种的基因组沉默子筛选。MAS-seq的建立对于构建沉默子图谱，了解沉默子的特征以及作用机制具有极其重要的意义。

根据本发明的一个方面，提供一种全基因组沉默子筛选系统，该系统包括MAS-seq载体，该MAS-seq载体包括强启动子、同源臂、标记基因、poly A位点，该MAS-seq载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。该MAS-seq载体在同源臂间插入沉默子序列时，可以大大降低标记基因mRNA的表达丰度，通过测序检测标记基因mRNA的表达量，表达量低的即表明插入序列为沉默子序列。由此可以用于大规模筛选基因组沉默子，该系统灵敏，且操作便捷，可大规模使用和广泛应用。

在某些实施方式中，该MAS-seq载体的强启动子包括hPGK、CMV、CAG、SV40、PMC1中的任一种。

在某些实施方式中，该MAS-seq载体的标记基因包括GFP、RFP、mChery、BFP中的任一种。

根据本发明的另一个方面，提供了一种全基因组沉默子筛选系统在筛选全基因组沉默子中的应用。由此，可以快速、高效，便捷的筛选出全基因组沉默子。

在某些实施方式中，全基因组沉默子筛选系统应用在筛选全基因组沉默子时的方法如下：

打断待测基因序列、将打断的基因片段与Illumina接头连接，并使用含有MAS-seq载体同源臂序列的引物进行PCR扩增；

将纯化后的PCR产物同源重组至MAS-seq载体，构建成MAS-seq筛选质粒；

将MAS-seq筛选质粒转染细胞，抽提RNA，并富集标记基因mRNA；

将标记基因mRNA进行反转录，获得cDNA，并将cDNA进行PCR扩增；

将纯化后的PCR扩增产物进行高通量测序，并对测序结果进行分析，筛选出标记基因表达量低的测序结果，对应沉默子插入位点的序列即为筛选出的沉默子序列。通过该方法，可以快速高效的筛选出基因组沉默子，且适用于任何类型的DNA序列筛选沉默子，具有广泛的适用性。

在某些实施方式中，含有MAS-seq载体同源臂序列的引物序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

根据本发明的再一个方面，提供了一种全基因组沉默子筛选系统在验证基因组沉默子中的应用。通过该全基因组沉默子筛选系统可以对待测序列是否为沉默子序列进行快速有效的验证。