[发明专利]一种基于液滴PCR快速检测单细胞的方法

说明书

一种基于液滴PCR快速检测单细胞的方法。该方法包括如下步骤：对经培养、富集的细胞进行固定后，加水重悬得到细胞悬液；将所述细胞悬液与含细胞裂解剂的PCR反应试剂直接混合作为分散相，将油相作为连续相，分别注入微流控芯片生成含单细胞的液滴；对得到的液滴进行PCR反应；对PCR反应后的液滴进行荧光信号检测及分析。本发明极大地简化了液滴制备和操作过程，降低了液滴生成芯片和试剂成本，提高了液滴PCR检测单细胞的速度、通量、灵敏度和特异性。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于液滴PCR(Polymerase ChainReaction，聚合酶链式反应)快速检测单细胞的方法。

背景技术

细胞作为生命活动的基本单元，与生命活动息息相关，细胞异质性往往包含着与疾病早期诊断、治疗等相关的重要信息，因此单细胞分析具有重要意义。PCR以其高灵敏度、高特异性的特点，广泛应用于检测单细胞，然而传统的获取单细胞的方法通常需要对细胞进行大量稀释或者采用显微操作技术来进行，步骤复杂繁琐，效率低，试剂消耗大。微流控技术通过将单细胞包裹在液滴中，使每一个液滴都成为一个密封的反应体系，提供了一种高通量、快速检测单细胞的途径。然而，在皮升液滴中，裂解试剂及细胞的裂解物对PCR反应具有极大的抑制作用。现存的方法需要先将细胞和裂解试剂包裹在液滴中，再与包裹反应试剂的液滴融合，这需要复杂的芯片设计和外部控制，对操作者的要求高，无法在多数实验室完成。操作液滴进行融合、分裂、再注入等都容易引起液滴融合，在延长检测时间的同时，也大大降低了检测的可靠性。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种基于液滴PCR快速检测单细胞的方法，以期至少部分地解决上述提及的技术问题中的至少之一。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于液滴PCR检测单细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤(1)对经培养、富集的细胞进行固定后，加水重悬得到细胞悬液；步骤(2)将所述细胞悬液与含细胞裂解剂的PCR反应试剂直接混合作为分散相，将油相作为连续相，分别注入微流控芯片生成含单细胞的液滴；步骤(3)对得到的液滴进行PCR反应；步骤(4)对PCR反应后的液滴进行荧光信号检测及分析。

基于上述技术方案，本发明的基于液滴PCR快速检测单细胞的方法，至少具备以下有益效果其中之一或其中一部分：

(1)本发明操作简单，检测通量高，检测速度快：细胞固定后使细胞中的酶失活，从而避免细胞裂解产物对PCR反应的抑制作用，在此基础上，细胞可直接与含细胞裂解剂的PCR反应试剂预先混合，使用一个简单的液滴生成芯片即可制备用于PCR反应的液滴；

(2)本发明检测灵敏度高、特异性强：进一步选用PFA固定可保持细胞结构，避免细胞破裂，使其中的酶失活，反复清洗后PFA不会抑制PCR反应进行。进一步选择添加对PCR反应无影响的牛胎血清蛋白和NP40细胞裂解剂，在不完全破坏细胞结构的同时，可增加细胞膜、核膜的通透性，使与蛋白缠绕的DNA更易接触引物和探针，大大提高检测灵敏度和特异性。

(3)本发明试剂消耗少，价格低廉，可靠性强：NP40细胞裂解液的引入有助于获得更小尺寸的高热稳定性的液滴，收集液滴的PCR管可直接放入PCR仪进行扩增，无需液滴热孵化、融合、再注入，更少的液滴操作可得到更可靠的检测结果。

附图说明

图1是本发明实施例1流动聚焦法生成含单细胞液滴的示意图；

图2是本发明实施例1在PCR反应前的包裹CaSki细胞的液滴；

图3A是本发明实施例1在PCR反应后的包裹CaSki细胞的液滴；

图3B是图3A的荧光信号观察结果；

图4是本发明实施例2在PCR反应后的包裹CaSki和C-33A细胞的液滴的荧光信号观察结果；