[发明专利]低产乙醛啤酒工业酵母的高通量筛选方法

说明书

本发明提出一种低产乙醛啤酒工业酵母的高通量筛选方法，属于发酵工程和微生物育种的技术领域。本发明通过对啤酒工业酵母进行⁶⁰Coγ诱变育种，获得庞大的突变菌株库；随后通过高浓度乙醛及乙醇‑双硫仑平板及其驯养液对突变菌株进行平板筛选和长期驯化，将驯养菌液涂布于筛选平板，获得初筛菌株；再通过低乙醛合成及强乙醛代谢的高通量复筛手段，获得低产乙醛啤酒工业酵母。经摇瓶水平啤酒模拟酿造体系的验证，突变菌株的乙醛产量降低了60％以上，且发酵液主体风味与出发菌株无异。本发明解决了目前对低产乙醛的啤酒工业酵母筛选难度大、效率低的问题。

技术领域

本发明属于发酵工程和微生物育种技术领域，尤其涉及一种低产乙醛啤酒工业酵母的高通量筛选方法。

背景技术

啤酒是世界三大古酒之一，起源于九千多年前的中东和古埃及地区，于二十世纪初传入中国。目前，中国已成为全球啤酒产销大国。伴随着我国啤酒行业的发展日趋成熟、啤酒市场逐步扩张，风味及稳定性一直是啤酒行业的研究热点。

乙醛(CH₃CHO)是啤酒中的一种高挥发性、高反应活性、低分子量的羰基化合物，直接影响了啤酒的风味和风味稳定性。常温常压下，沸点为21℃，易于与水混合，存在可逆平衡。此外，乙醛可以与大量亲核物质发生反应，易与啤酒中其他醛、酮和酯类化合物发生缩合反应。适量的乙醛会赋予啤酒独特的品质特征，若含量过高，易产生不愉快的青草、烂苹果等味道；若贮藏时间过长，甚至出现老化风味。

影响成品啤酒中乙醛含量高低的因素包括原辅料、啤酒工业酵母、酿造工艺、储存及物流条件等。长期工业实践中，学者们相继提出了啤酒中乙醛含量的控制措施。然而，控制生产工艺不具有普遍适用性，构建酵母工程菌不符合食品安全规范，难以彻底解决啤酒风味的问题。

啤酒工业酵母从根本上决定了啤酒产品中风味物质乙醛的形成和积累。发酵过程中，酵母将可发酵糖类通过EMP途径生成丙酮酸，在丙酮酸脱羧酶作用下，形成乙醛和CO₂。其中大部分乙醛受到酵母乙醇脱氢酶1的作用还原成乙醇，乙醇也可以在乙醇脱氢酶2的作用下氧化成乙醛；少量乙醛被乙醛脱氢酶氧化成乙酸。因此，筛选优良的低产乙醛啤酒工业酵母菌株将成为有效解决啤酒风味稳定性和啤酒食品安全问题的途径之一。

突变菌株的筛选指标主要包括关键酶活性变化和游离态乙醛含量。而低乙醛啤酒工业酵母菌株的选育，归根结底是筛选代谢物乙醛产量降低的啤酒工业酵母菌株。因此，准确地测定出发和改良菌株的乙醛产量是成功选育菌种的必要手段。

现阶段啤酒生产企业一般多用筛选培养基在试管、摇瓶、EBC管中发酵培养，利用气相色谱(GC)、高效液相色谱法(HPLC)和核磁共振技术(NMR)进行游离态乙醛含量的检测。菌株培养工作量大、效率低；GC法和HPLC法需要对样品进行固相微萃取或衍生化处理；NMR技术所依托的核磁共振仪价格昂贵，直接导致了检测成本的上升。因此，需要建立一套属于低产乙醛啤酒工业酵母菌株的简便、低成本的高通量筛选模型。

发明内容

本发明提供了一种低产乙醛啤酒工业酵母的高通量筛选方法，该方法解决了现有对低产乙醛的啤酒工业酵母筛选难度大、效率低的问题。

为了达到上述目的，本发明提供了一种低产乙醛啤酒工业酵母的高通量筛选方法，包括以下步骤：

对啤酒工业酵母进行⁶⁰Coγ诱变处理，构建突变菌株库；

利用高浓度乙醛平板及乙醇-双硫仑平板对突变菌株进行平板筛选，并利用对应上述各平板的液体驯化培养基对其进行长期驯化，将驯养菌液分别涂布于上述平板，获得初筛菌株；

利用低乙醛合成能力及强乙醛代谢能力对初筛菌株进行高通量复筛，得到复筛菌株，即低产乙醛啤酒工业酵母。

作为优选，获得初筛菌株具体包括以下步骤：