[发明专利]一种秀丽隐杆线虫对病原细菌遗忘的动物模型的建立方法

说明书

本发明公开一种秀丽隐杆线虫对病原细菌遗忘的动物模型的建立方法，具体包括以下步骤：将秀丽隐杆线虫进行同步化处理，培养至青年状态，将部分线虫加入到涂满PA14细菌平板上训练4h；训练完成后将其分别移入M9培养基中，设置0.5h、1h、2h、4h遗忘时间点，检测对照组线虫、PA14训练线虫、不同时间点遗忘线虫偏好指数，绘制遗忘曲线；通过检测病原处理前、处理时、移除后，线虫对病原细菌的偏好指数的变化以明确遗忘时间点。本发明所述方法建立的模型可用于研究秀丽隐杆线虫对病原菌的记忆遗忘机制，还用于研究病原菌与宿主之间的相互作用关系。

技术领域

本发明涉及一种秀丽隐杆线虫对病原细菌遗忘的动物模型的建立方法，属于生物模型构建技术领域。

背景技术

遗忘型轻度功能认知障碍、短暂性全面遗忘症、阿尔茨海默病(Alzheimer,sdisease，AD)等疾病都和遗忘行为异常相关。其中，轻度认知障碍(mild cognitiveimpairment，MCI)是介于正常衰老与痴呆之间的状态，分为遗忘型MCI(amnestic MCI，aMCI)和非遗忘MCI(non-amnestic MCI)。遗忘型MCI最易发展成为AD源性痴呆(dementiadue to AD)。在中国一项针对阿尔茨海默病以及其他痴呆病症的系统性研究显示，随着人口老龄化问题的凸显，AD的发病率在日趋升高。阿尔茨海默病必然会长期对中国的家庭、社会、经济以及公共卫生系统造成巨大的压力，对其发病的生物学机制深入研究已刻不容缓。遗忘行为异常是AD发病的重要特点之一，因此弄清遗忘行为异常的机制显得尤为重要。过往的研究主要以果蝇、小鼠为模型探索遗忘机制，但由于其遗传学操作复杂、耗时，因此得不到推广和普及。

自然环境中，秀丽隐杆线虫是生活在土壤中的一种微小生物，它们以土壤有机细菌为食物。线虫体型较小，长度约为3-5mm，按照性别可分为雄虫和雌雄同体两种，其中雌雄同体线虫为主要组成部分尤为常见，而雄虫较少一般比例约为千分之一。在整个发育阶段，大致可将其生活史划分为2个时期，分别为幼虫阶段和性成熟阶段。而幼虫阶段又可分为L1，L2，L3和L4，L4期线虫的生殖腺基本发育完全，接下来进入成虫期，这个时期线虫大量产卵。在实验室环境中培养线虫，其生活周期短、产卵量多、易于进行遗传学操作，大量线虫突变株已经构建完成。此外，线虫对气味、温度、光线等物理因素反应敏感，身体呈透明状，在发育过程当中，容易在显微镜下对其进行跟踪观察。作为第一个完成测序的多细胞生物体，其基因组约有40％和哺乳动物同源，并且线虫神经元之间的连接相对清楚，哺乳动物的一些重要的神经肽在线虫中也被发现，因此是研究神经元调控行为学变化的绝佳模型。因此，建立一种秀丽隐杆线虫病原遗忘模型非常有必要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种秀丽隐杆线虫对病原细菌遗忘的动物模型的建立方法，具体包括以下步骤：

(1)将秀丽隐杆线虫进行同步化处理，培养至青年状态，将部分线虫加入到涂满PA14细菌平板上训练4h。

(2)训练完成后，设置不同的遗忘时间点(0.5h、1h、2h、4h)，检测秀丽隐杆线虫、PA14训练线虫、不同时间点产生遗忘线虫偏好指数，绘制遗忘曲线。

(3)通过检测病原处理前、处理时、移除后，线虫对病原细菌的偏好指数的变化和恢复明确遗忘时间点。

优选的，本发明所述秀丽隐杆线虫进行同步化的具体过程为：

①将保存于固体平板上的线虫切小块置于新鲜的OP50平板上，20℃培养箱培养48小时，并注意观察，平板上出现大量虫卵即可；如果培养过程中出现食物不够的情况，则在平板中加入离心浓缩后的OP50食物。

②待平板上出现大量虫卵后，用M9溶液将线虫和虫卵冲洗于14ml的收集管中3000rpm，离心2分钟；冲洗过程一定要充分以免造成虫卵的大量损失。