[发明专利]一种鱼类靶向基因营养调控细胞模型的建立方法及应用

说明书

本发明属于鱼类细胞培养技术领域，公开了一种鱼类靶向基因营养调控细胞模型的建立方法及应用。所述方法包括鱼类肠道上皮细胞原代、传代培养与鉴定：(1)原代培养：采用的机械法加0.05vol％的胰蛋白酶温和性消化液的处理方法，对肠道细胞的损伤较少，有利于促进其增殖；(2)传代培养：传代培养过程中使用0.05vol％的胰蛋白酶温和性消化液进行消化，保持肠道细胞的活力，有利于细胞的传代培养；(3)鉴定：通过细胞免疫荧光技术鉴定鱼肠道上皮细胞。该方法提供的鱼类靶向基因营养调控细胞模型可以直接用于营养物质对靶向基因的作用机制研究及外源基因的功能研究。

技术领域

本发明涉及鱼类细胞培养技术领域，具体是涉及一种鱼类靶向基因营养调控细胞模型的建立方法及应用。

背景技术

鱼类靶向基因营养调控细胞模型的建立可以用于研究鱼类靶向基因营养调控的分子机制，且与活体鱼类个体实验比较，研究所花时间少，实验条件可以很容易地控制，在操作上可以实现批量化的大规模性实验，具有实验结果重复性好等优点，且构建的鱼类靶向基因营养调控细胞模型、实验成本与个体实验相比也降低了，体外细胞模型也接近于鱼体自身生理条件。

现代基础科学研究和水产动物营养产业发展需要建立鱼类细胞实验模型和研究的实验平台，这是推动鱼类的基础研究和相关产业技术研究发展的重要关键性领域。鱼类肠道上皮细胞是体外研究外源物质对鱼类的营养调控作用、饲料添加剂筛选的重要基础性实验平台，具有重要的科学意义和生产营养价值。然而，现有技术中，鱼类肠道上皮细胞研究领域目前还没有成熟的细胞系，且不能连续传代，因此利用从健康鱼体肠道分离肠道粘膜上皮细胞并进行原代与传代培养以及鉴定具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述背景技术的不足，提供一种鱼类靶向基因营养调控细胞模型的建立方法及应用，该方法提供的鱼类靶向基因营养调控细胞模型可以直接用于营养物质对靶向基因的作用机制研究及外源基因的功能研究。

为达到本发明的目的，本发明鱼类体外营养调控模型的建立方法包括鱼类肠道上皮细胞原代、传代培养与鉴定：

(1)原代培养：将鱼肠道组织进行无菌处理及机械剪碎、消化获得细胞组织沉淀，加入原代细胞培养液培养原代细胞；

(2)传代培养：细胞进行传代至第1-5代时，传代细胞消化时使用的细胞消化液为0.05vol％的胰蛋白酶(Trypsin)温和性消化液，细胞培养液中的表皮细胞生长因子浓度为10ug/ml，细胞培养液实行半换液方式；传代至5-10代时，使用的细胞消化液为0.05vol％的胰蛋白酶(Trypsin)温和性消化液，培养液中的表皮细胞生长因子浓度为5ug/ml，细胞培养液实行1/3培养液换液；10代以后传代细胞使用的细胞消化液为0.25vol％的胰蛋白酶(Trypsin)消化液，实行全部换液模式，细胞培养液中的表皮细胞生长因子浓度为5ug/ml；

(3)鉴定：通过细胞免疫荧光技术鉴定鱼肠道上皮细胞。

进一步地，所述鱼为淡水鱼，例如草鱼、鲤鱼、鲫鱼、胖头鱼、鳊鱼等。

优选地，所述鱼选取25g/尾的1龄健康草鱼。

进一步地，所述步骤(1)中无菌处理的方法为将肠道放于含有6ml D-PBS且加入2％双抗(青霉素200，000IU/l和链霉素200mg/l)的直径为10cm的培养皿里面保持组织活性，再利用剪刀与镊子剔除草鱼肠道外面的一层脂肪后剪成前、中、后三段且把小肠纵向剪开，然后放入新的含有D-PBS的直径为10cm的培养皿里面进行清洗，重复清洗后放入含75％酒精的培养皿中清洗杀菌处理，然后马上用镊子夹到含有D-PBS的培养皿里面进行漂洗去掉酒精，重复漂洗后将三段肠道分别放入三个无菌的EP管中。