[发明专利]罗非鱼精密肝切片损伤模型及其构建方法

说明书

本发明公开了罗非鱼精密肝切片损伤模型及其构建方法，所述方法采用环磷酰胺诱导罗非鱼精密肝切片，环磷酰胺的浓度在25mM以内。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)本发明首次采用环磷酰胺诱导罗非鱼精密肝切片构建损伤模型，为研究鱼类肝损伤机制及保肝药物的筛选和开发提供基础；(2)所述方法的诱导对象采用罗非鱼精密肝切片，其最大限度的模拟了在体状态，是更为可靠的研究肝脏代谢和体外诱导毒性的模型体系。

技术领域

本发明属于水产养殖技术领域，涉及一种肝脏切片的制备，具体为罗非鱼精密肝切片损伤模型及其构建方法。

背景技术

随着集约化养殖程度的不断提高，以及养殖密度的加大，导致养殖环境日趋恶化；同时抗生素和杀虫剂的滥用也造成鱼类病害频发，尤其是肝脏疾病。肝脏是鱼类物质和能量代谢的重要器官，也是机体重要屏障器官，其解毒和吞噬功能对机体有重要保护作用。肝损伤或病变往往导致鱼类机体代谢机能紊乱和抗病力降低，极易造成继发传染性疾病的爆发。因此，研究罗非鱼肝损伤的发病机制，研发保肝药物对于鱼类的肝保护有十分重要的意义。

临床上为了研究肝病的发病机制及药物作用机理，建立了实验性的肝损伤动物模型，利用这些具有生物学活性的肝损伤模型，可以快速而高通量地筛选护肝药物。然而在鱼类中，关于肝损伤模型研究还比较少，因此严重制约鱼类肝损伤机制以及保肝药物的筛选和开发。精密肝切片(precision-cut 1iver slice)技术是近几年兴起的一项研究肝组织体外代谢的方法。该技术保证了肝切片厚度、形状和大小一致，能有效降低切片损伤程度；精密肝切片的代谢与肝脏组织更吻合，能最大限度地模拟在体状态。精密肝切片的肝损伤模型是更为可靠的研究肝脏代谢及体外诱导毒性的模型体系。

环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)经肝细胞色素CYP450酶系代谢，生成了具有活性的代谢产物--磷酰胺氮芥、丙烯醛及氯乙醛。它们与DNA等生物大分子产生共价结合后，导致机体抗氧化防御体系的抗氧化能力下降，大量自由基形成，最终造成氧化应激性肝损伤。 CTX诱导的肝损伤模型在临床上有着广泛的应用和研究，但是在罗非鱼精密肝切片损伤模型没有相关的报道。

发明内容

解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，获得一种通过环磷酰胺诱导罗非鱼肝切片损伤模型的方法，本发明提供了罗非鱼精密肝切片损伤模型及其构建方法。

技术方案：罗非鱼精密肝切片损伤模型的构建方法，所述方法采用环磷酰胺诱导罗非鱼精密肝切片，环磷酰胺的浓度在25mM以内。

优选的，环磷酰胺的浓度为20mM。

优选的，所述罗非鱼精密肝切片由以下方法制得：将罗非鱼饲养于循环水系统中，随机抽取并采用麻醉放血处死，消毒后置于无菌状态中取肝脏，肝脏置于以氧饱和、pH为7.4的冰Krebs-Henseleit(克-亨氏液)缓冲液中，去除包膜及凝血，采用解剖刀处理为组织块并包埋入2.5％低熔点胶内；组织包埋物冷凝后置于含缓冲液的标本槽内切片。

优选的，罗非鱼体重为150±5g。

优选的，罗非鱼的饲养条件为27±2℃，pH6.8-7.6，DO5mg/L，NH₃0.05mg/L，H₂S0.01 mg/L；每天投喂量为鱼体质量的2％。

优选的，切片的厚度为300μm，且切片过程持续通氧。

优选的，精密肝切片后续的培养条件如下：将肝切片置于48孔板中、5片/孔，每孔加入 500μl L-15培养基，培养基中含1％S/P(青链霉素)，0.2％heparin(肝素)和5％FCS(小牛血清)，27℃、120次/分水平振荡培养。

优选的，环磷酰胺诱导罗非鱼精密肝切片的具体步骤为：肝切片经L-15培养基预培2h 后移除上清液，向其中加入含有环磷酰胺的L-15培养基继续培养，500μl/孔、27℃培养6h。