[发明专利]筛查甲状腺乳头状癌相关融合基因的引物、探针和方法

说明书

本发明提供了一种一管式筛查甲状腺乳头状癌相关融合基因RET‑PTC1、RET‑PTC2、RET‑PTC3的引物、探针和方法，方法包括：以cDNA为模板，依据所述的特异性扩增引物和探针进行同管Real‑time PCR扩增。该引物和探针经测试特异性好，灵敏度高，操作简便。本发明可快速检测样本中RET‑PTC1、RET‑PTC2、RET‑PTC3的存在，可为甲状腺乳头状癌辅助制定个体化治疗方案和疾病预后判断。

技术领域

本发明涉及一种临床检验用途的基因检测方法，采用探针实时荧光PCR技术，对人类PTC中RET基因重排RET-PTC1、RET-PTC2、RET-PTC3进行一管式筛查。

技术背景

甲状腺癌源于甲状腺内生长的恶性肿瘤或肿块，是最常见的内分泌恶性肿瘤，占所有人类恶性肿瘤的约4％，且甲状腺癌在全球范围内发病率在不断增加，全年龄段均可发病，20-55岁为高发年龄。该发病率的增加主要归因于甲状腺乳头状癌(papillary thyroidcarcinoma,PTC)。

RET基因是人类发现最早的致癌基因之一，也是第一个被提出作为肿瘤标志物的基因。RET原癌基因位于染色体10q11.2，编码一种跨膜酪氨酸激酶受体蛋白，在甲状腺滤泡旁细胞中高表达。RET-PTC重排是染色体异位或臂内倒位导致的RET基因的3’端和其他基因的5’端基因结合产生的重排导致了此受体形成嵌合体而被活化，根据5’端基因的不同将重排分为多种类型，包括RET-PTC1、RET-PTC2、RET-PTC3等13种之多。其中RET-PTC1、RET-PTC2、RET-PTC3是重排类型中发病率最高，由RET基因分别和CCDC6(H4)、PRKAR1A、NCO4(ELE1)基因臂内倒位融合形成，所有融合包含完整的酪氨酸激酶受体，使RET-PTC蛋白质能激活MAPK信号通路。

RET-PTC在PTC中的重排率取决于肿瘤的组织学亚型、地域因素、检测方法以及辐射暴露史等。RET-PTC早期被认为是PTC特有的标志物，但研究发现在甲状腺良性病变中也存在RET-PTC重排，并与甲状腺结节的高生长率相关。因此，RET-PTC不能作为PTC特有的标志物。一项纳入64例PTC患者的研究发现，RET重排阳性率仅为3.1％，与临床病理特征无明显相关性。该研究的缺点是研究对象较少，因而不能完全评估RET重排在RET中的表达率。也有研究发现，在有放射暴露史的人群中，RET重排率高达65％，在45岁的患者中，RET基因重排频率明显低于45岁的患者。目前RET重排在PTC中的检出率差异较大，可能与检测方法、种族及病例数有关。

RET-PTC重排检测有助于甲状腺癌的诊断，克隆性RET-PTC检测是预测乳头状癌的有力指标。目前的研究表明RET-PTC重排除常见于甲状腺癌的中，也可见于甲状腺良性病变中，如桥本氏甲状腺炎等。

目前基因重排检测的常用技术有荧光原位杂交技术(FISH)、RT-PCR等方法。FISH检测结果较为直观，但是试验过程繁琐，涉及试剂种类繁多，费时费力，且结果需经验丰富的专业人士来判读，结果判读存在较大的主观性。RT-PCR采用Taqman探针荧光定量技术，综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了PCR产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了敏感度，其结果用拷贝数表示，实现了对PCR产物的准确定量，易于统一标准，与定性PCR技术相比，具有特异度好，灵敏度高，线性关系好，操作简单，自动化程度高、防污染，有较大的线性范围等优点。能够满足RET-PTC基因重排的检测，被认为是目前首选检测方法，用于评价治疗效果、预测预后。实时荧光定量PCR中常见的方法有SYBR GreenI染料法，双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBRGreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针杂交法成本又较为昂贵。因此本发明采用实时荧光PCR技术结合Taqman探针法应用于RET-PTC基因重排检测。

发明内容