[发明专利]一种免疫细胞冻存方法

说明书

本发明提供了一种免疫细胞冻存方法，包括如下步骤：S1.获取免疫细胞；S2.获取人自体血浆；S3.制备细胞冻存液；S4.进行细胞冻存。本发明提供的一种免疫细胞冻存方法，可以有效防止免疫细胞冷冻损伤，并提高免疫细胞的复苏成活率，细胞冻存液中加入的白藜芦醇，能够促进复苏后的免疫细胞的增殖能力，从而提高冻存免疫细胞复苏后的活性，羟乙基淀粉、丙二醇和聚乙二醇可以替代二甲基亚砜的保护作用，降低二甲基亚砜的使用量，保证细胞在接近冰点时，细胞内的水分不会结晶，对细胞的损伤小，细胞冻存液中加入的人自体血浆不会引入外源蛋白，降低了动物病源污染的可能性，避免了外源血清存在的安全隐患。

技术领域

本发明是一种免疫细胞冻存方法，属于细胞工程技术领域。

背景技术

免疫细胞疗法是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法，它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，以激发、增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。例如将免疫细胞冻存起来，待到需要时立刻复苏并进行回输。

细胞冻存时经常会采用渗透性保护剂减少冻存过程对细胞的损害，目前，常用的冻存保护剂为二甲基亚砜(DMSO)，这种物质可以快速透入细胞内部，提高细胞膜对水的通透性，使水分在细胞冻结前透出细胞外形成冰晶，减少细胞内形成冰晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。

现有细胞冻存液多采用二甲基亚砜和动物血清混合，由于二甲基亚砜的含量较高，因此具有相当的毒性，不利于病人的身体健康，并且动物血清中含有大量的异种蛋白，有传染病、过敏反应或者免疫排斥的风险。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种免疫细胞冻存方法，可以有效防止免疫细胞冷冻损伤，并提高免疫细胞的复苏成活率。

为了实现上述目的，本发明提供了一种免疫细胞冻存方法的制备方法，包括如下步骤：

S1.获取免疫细胞

S2.获取人自体血浆

S3.制备细胞冻存液

细胞冻存液包括二甲基亚砜、细胞培养基、人血清白蛋白、糖类、白藜芦醇、羟乙基淀粉、丙二醇、聚乙二醇和人自体血浆，将细胞冻存液的各组成成分混匀后，在2-5℃条件下保温2h，得到细胞冻存液；

S4.进行细胞冻存

将步骤S3制备的细胞冻存液缓慢加入步骤S1获得的免疫细胞中，制成细胞冻存悬液，然后在5℃条件下保温30min，在-20℃保存2h，在-50℃保存3h后，降温至-80℃，保存5h，之后放入-20℃条件下保存2h，然后放入-80℃条件下保存5-8h，最后转移至液氮罐中保存。

采用上述方案，细胞培养基可以保持免疫细胞的渗透压、酸碱平衡并提供营养，人血清白蛋白有助于保护细胞结构不被破坏，延长了细胞的存活期，糖类能够保证细胞复苏后其增值能力不受影响，用含有白藜芦醇的冻存液冻存免疫细胞，能够促进复苏后的免疫细胞的增殖能力，羟乙基淀粉、丙二醇和聚乙二醇可以替代二甲基亚砜的保护作用，降低二甲基亚砜的使用量，保证细胞在接近冰点时，细胞内的水分不会结晶，对细胞的损伤小，人自体血浆与血清成分相似，含有免疫细胞生长所需要的细胞因子及营养物质，不含有动物血清，不会引入外源蛋白，降低了动物病源污染的可能性，避免了外源血清存在的安全隐患，免疫细胞冻存时，首先逐步降温至-80℃，能够减小细胞的损伤，之后放入-20℃条件下保存，再放入-80℃条件下保存，可以提高免疫细胞冻存后再复苏的活性。

优选的，步骤S1具体为，将生理盐水、Ficoll分离液与外周血或脐血混合，在2000rpm的转速下，离心8-10分钟，吸取中间白膜层，加生理盐水清洗两遍，分离得到免疫细胞。

采用上述方案，从人体的外周血或脐血中获取免疫细胞。

优选的，步骤S1中，离心的温度为30-37℃。