[发明专利]一种壳多糖酶3样蛋白1试剂盒及其制备方法

说明书

本发明公开了一种壳多糖酶3样蛋白1（CHI3L1）试剂盒，本试剂盒是基于超顺磁性纳米微粒作为固相载体，吖啶酯作为发光标记物的直接化学发光平台，利用经典的双抗体夹心法捕获血清中的待测物，应用全自动化学发光仪进行实验的测试和试剂优化调试。本发明可准确的反映患者肝炎症活动度以及纤维化程度。针对CHI3L1的检测可作为一种非创伤性辅助肝纤维化诊断方法，具有较大的应用价值。

技术领域

本发明涉及医学、免疫和体外诊断领域，具体讲是一种壳多糖酶3样蛋白1试剂盒及其制备方法。

背景技术

Chitinase-3-like protein 1(CHI3L1)是一种分泌型糖蛋白，约40kDa大小，名字来自N端三个氨基酸存在于分泌形式及其相对分子质量。

通过系统生物学方法，结合二代测序表达谱技术和蛋白质组学技术，我们发现CHI3L1可作为肝硬化的诊断、预后评估、治疗效果监测及病程监测的标志物。血清CHI3L1水平在酒精性肝硬化病人中升高，Kamal等的研究表明血液中的CHI3L1蛋白水平与丙肝病毒慢性感染和肝纤维化有关。此外，CHI3L1也可以作为预防及治疗的良好标靶。

目前肝纤维化的诊断金标准为肝活组织病理学检查，但是检查的有创性极大地限制了其临床应用，目前大量的肝纤维化无创诊断新技术的研究，都是为了替代肝穿刺，但是总体临床实用性不能令人满意，进一步探索新的血清标志物十分重要。CHI3L1在组织重塑中扮演重要的角色，作为一个较为新兴的血清学标志物，较其他传统的肝纤维化标志物(如透明质酸，IV型胶原，III型前胶原氮端肽，层粘连蛋白，纤维连接蛋白等)具有更好的敏感性和特异性。因此对肝纤维化疾病患者的早期诊断具有显著价值。目前检测CHI3L1常用ELISA法、化学发光免疫分析法(包括酶促化学发光法CLEIA和直接化学发光法CLIA)，其中化学发光已开始应用于临床检测及科学研究，其敏感性与特异性较传统酶联免疫法都有所提高。但目前检测壳多糖酶3样蛋白1产品少，检测平台有局限性，检测效率低。

发明内容

本发明的目的在于开发出一款基于磁微粒化学发光法，可用于高通量临床自动化无创检测的诊断试剂盒，解决目前检测壳多糖酶3样蛋白1产品少，检测平台有局限性，检测效率低的问题，提供一种速度快、准确度高的高通量化学发光法检测CHI3L1试剂盒及制备方法。

本发明的技术解决方案如下：一种壳多糖酶3样蛋白1试剂盒，包括固相试剂、发光试剂、校准品及质控品；

所述固相试剂包括如下含量的各成分：

固相试剂缓冲液：缓冲液10-100mM、无机盐5-30g/L、蛋白保护剂2-40g/L、表面活性剂0.01-3g/L、防腐剂0.5-1.53g/L、阻断剂；

磁微粒：浓度不低于0.1g/L的包被有CHI3L1抗体的磁微粒。

作为优化，所述固相试剂的制备方法为：将基于羧基官能团的磁性微粒，经过EDC/sulfo-NHS两步法进行活化，活化清洗后，磁性微粒表面羧基变成具有活性的中间酯，按照1mg磁性微粒交联20μg CHI3L1包被抗体的比例进行交联，抗体结构上的伯胺基和磁性微粒表面活化酯结合形成稳定的共价结构，清洗掉未结合的游离抗体后，加入封闭剂封闭掉未反应的剩余活化中间酯，抗体即可稳定的固定在磁性微粒表面，按照所需的浓度0.1～0.6mg/ml稀释成工作液浓度即完成固相试剂的制备。

作为最优化，所述固相试剂的具体制备方法为：

a.羧基磁珠充分混匀后取出1ml(10mg/ml)置于离心管中；

b.用活化缓冲液清洗磁珠3次，加1ml活化缓冲液重悬后备用；

c.分别称取一定质量的活化剂EDC和sulfo-NHS随后加入对应体积的活化缓冲液至浓度为10mg/ml；