[发明专利]一种基于Illumina测序平台的游离DNA文库构建用试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种基于Illumina测序平台的游离DNA文库构建用试剂盒，其特征在于，包括末端修复和加A用酶组合物、末端修复和加A的缓冲液、连接酶、连接酶缓冲液、接头、PCR扩增反应混合液和引物。

2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述末端修复和加A用酶组合物包括T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和Klenow片段；所述T4多聚核苷酸激酶的工作浓度为0.1～0.5U/μL；

所述T4 DNA聚合酶的工作浓度为0.04～0.1U/μL；

所述Taq DNA聚合酶的工作浓度为0.025～0.075U/μL；

所述Klenow片段的工作浓度为0.005～0.02U/μL。

3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述末端修复和加A的缓冲液包括Tris-HCl、MgCl₂、DTT、ATP、dNTP、dATP、PEG 8000和水；

优选的，所述Tris-HCl的工作浓度为50～100mM；

所述MgCl₂的工作浓度为10～20mM；

所述DTT的工作浓度为5～10mM；

所述ATP的工作浓度为2～5mM；

所述dNTP的工作浓度为0.1～1mM；

所述dATP的工作浓度为1～10mM；

所述PEG 8000的工作质量浓度为1％～10％。

4.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述连接酶为T4 DNA连接酶；

所述T4 DNA连接酶的工作浓度为15～60U/μL。

5.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述连接酶缓冲液包括Tris-HCl、MgCl₂、DTT、ATP和PEG 8000；

优选的，所述Tris-HCl的工作浓度为30～100mM；

所述MgCl₂的工作浓度为5～20mM；

所述DTT的工作浓度为0.5～2mM；

所述ATP的工作浓度为0.5～2mM；

所述PEG 8000的工作质量浓度为5％～15％。

6.根据权利要求1～5任意一项所述试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增反应混合液为VAHTS HiFiAmplificationMix；

所述引物优选为UDI PrimerMix。

7.权利要求1～6任意一项所述试剂盒在DNA文库构建或高通量测序中的应用。

8.一种基于权利要求1～6任意一项所述试剂盒的DNA文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将血液样本提取的游离DNA与所述末端修复和加A用酶组合物、末端修复和加A的缓冲液混合进行末端修复和加A反应，得到末端修复和加A产物；

2)将所述末端修复和加A产物、接头、连接酶和连接酶缓冲液合进行连接接头，得到带接头产物；

3)将所述带接头产物纯化后，与PCR扩增反应混合液混合，用引物进行扩增，得到扩增产物，再次纯化，得到DNA文库。

9.根据权利要求8所述DNA文库构建方法，其特征在于，步骤1)中末端修复和加A反应的反应条件为先20～37℃保持10～20min，再70～75℃保持10～30min，4℃保存；

所述末端修复和加A反应的反应体系优选为50μL，包含1～100ng游离DNA、工作浓度的末端修复和加A用酶组合物和末端修复和加A的缓冲液。

10.根据权利要求8所述DNA文库构建方法，其特征在于，步骤2)中连接接头的反应条件先在20～25℃保持10～30min后再在4℃条件保存或16℃过夜；

步骤3)中所述扩增的反应条件优选为95～98℃保持45s～180s；95～98℃保持10～30s，55～60℃保持10～30s，70～75℃保持30～50s，4～12个循环；70～75℃保持5～10min；4℃保存。