[发明专利]用于无细胞MeDIP测序的合成加标对照及其使用方法

权利要求书

1.一种捕获并分析样品中无细胞甲基化DNA的方法，所述方法包括以下步骤：

a.对所述样品进行文库制备以允许随后对所述无细胞甲基化DNA进行测序；

b.添加预定量的一组对照合成DNA片段，其中所述对照合成DNA片段各自具有基本上不与目标基因组序列对齐的已知核酸序列，并且其中所述一组对照合成DNA片段中的至少一些所述对照合成DNA片段被甲基化；

c.使所述样品变性；

d.使用对甲基化多核苷酸具有选择性的结合剂捕获无细胞甲基化DNA和所述对照合成DNA片段；以及

e.对所捕获的无细胞甲基化DNA和所述对照合成DNA片段进行扩增和测序。

2.根据权利要求1所述的方法，还包括：

f.基于经测序的所述对照合成DNA片段计算所述样品中所述无细胞甲基化DNA的量、浓度或重量摩尔浓度。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述一组对照合成DNA片段包含3至7个预定片段长度。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述一组对照合成DNA片段包含3个预定片段长度。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述对照合成DNA片段的长度为50至500个碱基对(bp)，优选长度为80bp至320bp。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述3个预定片段长度分别是80bp、160bp和320bp。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述对照合成DNA片段具有0％至100％、优选25％至75％的鸟嘌呤和胞嘧啶(G+C)合并含量。

8.根据权利要求4所述的方法，其中所述3个预定片段长度分别具有35％、50％和65％的G+C含量。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述对照合成DNA片段中的每一个包含一数量的CpG二核苷酸，所述数量的范围在按碱基对计的所述片段长度的0到1/2之间。

10.根据权利要求8所述的方法，其中所述对照合成DNA片段中的每一个包含1至25个CpG二核苷酸，优选1至16个CpG二核苷酸。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述对照合成DNA片段具有SEQ ID NO:1-59中一个或多个所示的核酸序列。

12.根据权利要求1所述的方法，还包括：

i.对所述捕获的无细胞甲基化DNA和所述对照合成DNA片段进行测序；

ii.将经测序的无细胞甲基化DNA与所述对照合成DNA片段的已知核酸序列进行比较；以及

iii.将来自(ii)的任何不匹配的DNA与所述目标基因组序列进行比较。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述一组对照合成DNA片段中一半的所述对照合成DNA片段是甲基化的，而另一半是未甲基化的。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述一组对照合成DNA片段包含第一甲基化序列和第二未甲基化序列。

15.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述一组对照合成DNA片段中的所有所述对照合成DNA片段都是甲基化的。

16.根据权利要求2所述的方法，包括在扩增前使用独特分子标识符(UMI)衔接子估计所捕获的无细胞甲基化DNA的量。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述结合剂是包含甲基-CpG结合结构域的蛋白质。