[发明专利]合成向导RNA、其组合物、方法和用途

权利要求书

1.一种方法，其包括：使第一RNA与第二RNA接触，

其中所述第一RNA和所述第二RNA包括至少五个互补的RNA核苷酸，并且其中所述接触形成茎结构或茎环结构，以及

用连接酶

(i)在所述茎结构内

(ii)或在所述茎结构的端部处连接所述第一RNA和所述第二RNA，从而在所述茎结构的所述端部处形成环。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述接触形成茎结构，并且所述连接酶在所述茎结构的所述端部处连接所述第一RNA和所述第二RNA，从而在所述茎结构的所述端部处形成环。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述接触形成茎环结构，并且所述连接酶在所述茎环结构的茎内连接所述第一RNA和所述第二RNA。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述连接酶选自由以下组成的组：T4RNA连接酶1、T4 RNA连接酶2、RtcB连接酶、热稳定性5'App DNA/RNA连接酶、ElectroLigase、T4 DNA连接酶、T3 DNA连接酶、T7 DNA连接酶、Taq DNA连接酶、SplintR连接酶、大肠杆菌DNA连接酶、9°N DNA连接酶、CircLigase、CircLigase II、DNA连接酶I、DNA连接酶III和DNA连接酶IV。

5.根据权利要求2所述的方法，其中所述连接酶是T4 RNA连接酶1。

6.根据权利要求3所述的方法，其中所述连接酶是T4 RNA连接酶2。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一RNA和/或所述第二RNA是化学合成的。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一RNA是成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)RNA(crRNA)并且所述第二RNA是反式激活RNA(tracrRNA)。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中产生向导RNA(gRNA)。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一RNA和/或所述第二RNA是化学合成的。

11.根据权利要求1到9中任一项所述的方法，其中所述第一RNA和/或所述第二RNA是酶促合成的。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中用连接酶连接所述第一RNA和所述第二RNA在所述第一RNA与所述第二RNA之间产生磷酸二酯键。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一RNA和/或所述第二RNA核苷酸经工程化以允许非共价组装。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述茎环的长度介于约2-50个核苷酸之间。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一RNA和所述第二RNA包括至少两个具有完全互补性的RNA核苷酸。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述第一RNA和所述第二RNA包括至少三个、四个、五个、六个或七个具有完全互补性的连续RNA核苷酸。

17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述具有完全互补性的RNA核苷酸存在于顶部茎和/或底部茎中。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一RNA和所述第二RNA在由所述第一RNA和所述第二RNA形成的下部茎处包括至少五个、六个或七个互补的连续RNA核苷酸。