[发明专利]定量PCR方法及用于其的试剂盒

说明书

本发明提供经改良的定量PCR法(qPCR法)，其用于测定人细胞中的靶基因含量，能够例如在细胞疗法中以更高的精度分析细胞动力学。本发明的qPCR法包括下述步骤：将与靶基因不交叉的规定量的外源DNA作为用于校正靶基因的测定量的外标添加至含有人细胞的生物体试样中。

技术领域

本发明涉及定量PCR(定量聚合酶链式反应，quantitative polymerase chainreaction：qPCR)法及用于其的试剂盒。更详细而言，本发明涉及用于在qPCR法中校正靶基因的定量结果的方法及用于实施该方法的试剂盒。

背景技术

在施予基因工程化细胞的疗法、例如施予表达对特定肿瘤具有特异性的CAR(嵌合抗原受体)的T细胞(CAR-T细胞)的细胞疗法中，把握施予后的细胞数在生物体内的动力学(细胞动力学)对于把握治疗效果及安全性(副作用)、建立恰当的治疗方针是重要的。

例如，非专利文献1中，记述了为了治疗急性成淋巴细胞性白血病(acutelymphoblastic leukemia：ALL)及慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia：CLL)而施予Tisagenlecleucel(研发编号(code name)CTL019)、即含有靶向CD19阳性B细胞的CAR-T细胞的制剂时的生物体内的细胞动力学。可期待所施予的CAR-T细胞在生物体内增殖，能够持续保持一定的细胞数。对于该CAR-T细胞的血液中的细胞数而言，其与作为治疗对象的ALL及CLL的症状呈相关性地变化，并认为其也与作为该制剂的毒性而可能引起的细胞因子释放综合征(CRS)的严重程度相关。因此，可认为对于这种制剂而言，CAR-T细胞的血液中细胞数的动力学是用于评价治疗效果和安全性这两个方面的重要信息。非专利文献1中，作为反映CAR-T细胞数的指标，使用每1μg基因组DNA(gDNA)中的CAR-T基因的拷贝数(拷贝/μg gDNA)。图1中示出该拷贝数于自细胞移植时(约10³拷贝/μg gDNA)的数天急剧降低(约10¹拷贝/μg gDNA)，在此之后急剧上升(约10⁴～10⁶拷贝/μg gDNA)。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Mueller等，Blood 2017 130：2317-2325；doi：https://doi.org/10.1182/blood-2017-06-786129.

发明内容

发明所要解决的课题

以往，对于由血液等检体制备的生物体试样中的细胞数而言，如例如非专利文献1那样通过以该细胞的特异性基因为靶标的定量PCR(qPCR)法来以基因拷贝数的形式进行定量。此时，靶基因的拷贝数通常将基因组DNA(gDNA)作为内标(internal standard)，基于例如由基因组中的拷贝数众所周知的基因(例如RNaseP基因)的定量值换算而得的gDNA量进行标准化，使用例如“拷贝数/μggDNA”这样的单位表示为每单位量gDNA的拷贝数。

但是，迄今为止，尚未验证上述基于以往的定量方法的测定值、基于此测定值的细胞动力学是否适合作为用于评价细胞疗法的效果、安全性的指标。

本发明的课题为提供能够例如在细胞疗法中以更高的精度分析细胞动力学的改良qPCR法。

用于解决课题的手段

本申请发明人发现，对于根据以往的常规qPCR法将gDNA作为内标、使用“拷贝/μggDNA”的单位表示的靶基因的测定值而言，从一些观点出发，可能不具有足以用作用于分析细胞疗法中所施予的CAR-T细胞等的动力学的信息的准确性。