[发明专利]通过靶向LAMA1基因来治疗肌营养不良症的方法

权利要求书

1.一种多核苷酸，其包含下述碱基序列：

(a)编码核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录激活因子的融合蛋白的碱基序列，和

(b)编码靶向人类LAMA1基因的表达调控区中的下述连续区域的指导RNA的碱基序列：(i)在SEQ ID NO：15、20、25、50、56或61中阐述的连续区域，(ii)在SEQ ID NO：124中阐述的连续区域，或(iii)在SEQ ID NO：178、193或195中阐述的连续区域。

2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中编码指导RNA的碱基序列包含：

(i)在SEQ ID NO：15、20、25、50、56或61中阐述的碱基序列，

(ii)在SEQ ID NO：124中阐述的碱基序列，

(iii)在SEQ ID NO：178、193或195中阐述的碱基序列，

或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的所述碱基序列。

3.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，其中所述转录激活因子选自VP64、VP160、VPH、VPR、VP64-miniRTA(miniVR)和microVR、其具有转录激活能力的变体。

4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中所述转录激活因子是miniVR。

5.根据权利要求1至4中的任一项所述的多核苷酸，其中所述核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白是dCas9。

6.根据权利要求5所述的多核苷酸，其中所述dCas9源自于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。

7.根据权利要求1至6中的任一项所述的多核苷酸，其还包含用于编码指导RNA的碱基序列的启动子序列和/或用于所述编码核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录激活因子的融合蛋白的碱基序列的启动子序列。

8.根据权利要求7所述的多核苷酸，其中所述用于编码指导RNA的碱基序列的启动子序列选自U6启动子、SNR6启动子、SNR52启动子、SCR1启动子、RPR1启动子、U3启动子和H1启动子。

9.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中所述用于编码指导RNA的碱基序列的启动子序列是U6启动子。

10.根据权利要求7至9中的任一项所述的多核苷酸，其中用于所述编码核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录激活因子的融合蛋白的碱基序列的启动子序列是遍在启动子或肌肉特异性启动子。

11.根据权利要求10所述的多核苷酸，其中所述遍在启动子选自EFS启动子、CMV启动子和CAG启动子。

12.根据权利要求10所述的多核苷酸，其中所述肌肉特异性启动子选自CK8启动子、肌球蛋白重链激酶(MHCK)启动子、肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、合成C5-12(Syn)启动子和unc45b启动子。

13.一种载体，其包含根据权利要求1至12中的任一项所述的多核苷酸。

14.根据权利要求13所述的载体，其中所述载体是质粒载体或病毒载体。

15.根据权利要求14所述的载体，其中所述病毒载体选自腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体和慢病毒载体。

16.根据权利要求15所述的载体，其中所述AAV载体选自AAV1、AAV2、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9及其变体。