[发明专利]基于III型CRISPR/Cas的诊断

说明书

本发明涉及基于成簇的规律间隔的短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)的核糖核酸检测系统。本发明进一步涉及借助该系统确定样本中存在或不存在靶核酸分子的方法，并且涉及包含根据本发明的核糖核酸检测系统的装置。

技术领域

本发明涉及CRISPR/Cas相关核酸检测系统和其在诊断应用中的广泛用途。

背景技术

在过去的十年中，分子生物学领域有几项突破性的发现，这些发现的影响远远超出了其自身领域。毫无疑问，CRISPR/Cas(成簇的规律间隔的短回文重复，ClusteredRegularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR/相关基因)能被认为是这些发现之一。CRISPR/Cas系统被识别为原核适应性免疫系统，提供针对外来遗传元件(例如噬菌体和质粒)的序列特异性防御。然而，CRISPR/Cas系统允许在大多数(若不是全部)生物体中进行遗传干扰，这将对所有技术领域产生巨大影响。

CRISPR防御能被描述为由三个阶段组成的过程：适应、表达和干扰(Rath et al.，2015.Biochimie 117：119-128；Makarova et al.，2011.Nat Rev Microbiol 9：467-477)。在适应阶段，遗传片段从外来入侵实体中获取并存储在CRISPR储存器中(Jackson et al.，2017.Science 356：eaa15056)。这种储存器包含称为间隔区的外来DNA序列，其被重复的DNA序列(重复子)分开。CRISPR基因座的表达(阶段II)引起长的RNA分子的转录，其随后被加工成多个CRISPR RNA(crRNA)(Brouns et al.，2008.Science 321：960-964)。此外，细胞表达Cas蛋白，Cas蛋白是CRISPR/Cas系统的效应物，通过结合crRNA形成核糖核蛋白(RNP)复合物。一旦外来遗传元件由于与crRNA的序列互补而被检测到，相关Cas蛋白将使用其核酸酶活性降解入侵实体，这通常被描述为CRISPR防御过程的干扰阶段。

由于过去十年致力于CRISPR/Cas的大量研究，大量系统在细菌和古细菌界中被发现(Fenner et al.，2007.J Biomol Screen 20：1027-1039；van der Oost et al.，2009.Trends Biochem Sciences 34：401-407)。已经对CRISPR/Cas系统进行了分类。I类系统利用多亚基Cas复合物，而II类系统仅使用单个Cas蛋白来介导其活性。通常基于特征基因的存在表征不同类型(Wright et al.，2016.Cell 164：29-44)。

与可以区分许多CRISPR/Cas系统的差异相反，绝大多数系统具有功能上的相似性。几乎所有的CRISPR/Cas类型都作为DNA靶向RNP，这可能与大量的基于DNA的入侵实体有关。相反，基于RNA性质的入侵元素在原核世界中并不常见。因此，III型CRISPR/Cas系统已经进化为靶向RNA序列，这有些令人惊讶(Wright et al.，2016.Cell 164：29-44；Hale etal.，2009.Cell 139：945-956)。研究将这种异常活动归因于入侵噬菌体的转录产物的降解，从而阻止它们裂解细胞(Jiang et al.，2016.Cell 164：710-721；Goldberg et al.，2014.Nature 514：633-637)。III型系统属于I类，意味着RNPs由多个亚基组成。

具有三种不同类型的核酸酶活性，III型系统能被认为是独特的。此外，信使分子环状寡腺苷酸(cyclic oligoadenylate，cOA)的产生并未归因于任何其他CRISPR/Cas系统。利用这些特征可能会产生可视化靶点识别的新方法，这使得III型系统适合应用于新型诊断工具。

发明内容