[发明专利]使用固相载体的核酸扩增方法

说明书

本发明的使用固相载体的核酸扩增法包括：将包含mRNA的靶核酸捕捉到固相载体上以在固相上进行互补链合成，通过核酸外切酶处理降解去除固相上的未反应的靶捕捉用核酸，之后进行mRNA降解和在链终止核苷酸三磷酸存在下的基于TdT反应的同聚物添加。根据本发明的方法，不受固相上酶与DNA底物的量比过高、反应时间过长、以及试剂批次差异的影响，由微量的样品即可稳定且高效地扩增cDNA。另外，根据本发明的扩增法，可扩大同时进行使用DNA标记抗体等用寡核酸标记的特异结合分子的分析和转录物的分析的技术的应用范围。

技术领域

本发明涉及使用固相载体的核酸扩增方法。

背景技术

近年来，已经使用各单个细胞等微量样品进行了网罗性基因表达分析。这种技术可实现单细胞RNA-seq分析(单细胞转录组(single cell transcriptome：SCT)分析)，其网罗性地捕捉数百～万个单位的各个细胞的性质，关系到细胞群内的多态性的有无、或新的细胞亚群的鉴定、与病情相关的特殊的细胞群的鉴定，要在人类中制作单个细胞水平的图谱的国际项目于2016年启动(非专利文献1)等，成为以迄今为止所没有的分辨率推动生物学理解的原动力。

作为其他的代表性的微量样品，可列举：为了癌症患者的诊断而采集的原发灶/转移灶的活检样本中所含的肿瘤浸润T细胞。从抗PD-1抗体等作为免疫疗法的本质的CTL的实际状态为CD8⁺ T细胞的观点来看，测定具有癌抗原特异性识别能力的CD8⁺T细胞被诱导到何种程度的方法备受关注(非专利文献2)。作为其测定方法之一，有下述方法：分析CD8⁺ T细胞上的T细胞受体(T Cell Receptor; TCR)的序列以确定TCR组库(repertoire) (克隆的种类和各克隆的存在频率)，讨论肿瘤特异性克隆的应答，还报道了：实际上TCR组库变动与抗CD4抗体对癌症的治疗效果相关(非专利文献3)。然而，肿瘤浸润T细胞的大部分细胞是癌细胞或组织细胞，在大多数情况下T细胞的含量极少。因此，为了进行SCT分析或癌症部位的稳健的TCR组库分析，开发以高灵敏度且高通量地扩增由样本提取的mRNA或来源于来自样本的各个T细胞的mRNA的方法的重要性日益增加。

作为由微量样品进行的mRNA扩增法，有在96孔板中分别注入各个细胞或微量mRNA以进行扩增的Smart-Seq2等液相系统(专利文献1、非专利文献4)、或利用微通道形成小液滴并在各小液滴中捕捉1个细胞的10×Genomics公司的Chromium等小液滴系统(专利文献2)、使用固相珠粒捕捉各个样品的mRNA的方法等。虽然Smart-Seq2为高灵敏度，但其使用流式细胞仪在96孔或384孔板上对各个细胞进行分选，因此通量低、成本高。另一方面，10×Chromium等小液滴系统虽然通量高，但其问题在于与Smart-Seq2相比灵敏度大幅变差(非专利文献5)。另外，液相系统/小液滴系统两者均发生反应液的带入，因此作为用于溶解(裂解)细胞的试剂，无法使用具有强蛋白变性作用的表面活性剂，问题在于难以分析RNA降解酶多的细胞等。