[发明专利]禽肠样体

说明书

提供了用作禽肠的模型的衍生自禽肠组织的体外三维细胞构建体，其包含组织成肠绒毛和隐窝的禽细胞。适当地，构建体包含模拟鸡肠道的顶端表面的外表面。还提供了制造细胞构建体的方法和构建体作为体外肠模型系统以检查试剂的用途，所述试剂包括但不限于微生物、疫苗、药物、饲料添加剂、毒素、益生元(pre‑biotic)、后生元(post‑biotic)、益生元益生菌后生元(pre pro post biotic)、治疗物、细胞、基因构建体、蛋白质、免疫调节剂、肠效应剂、候选肠效应剂、细胞信号传导抑制剂或细胞信号传导激活剂。

发明领域

本发明涉及三维(3D)肠样体培养物，其可以例如用于多细胞生物学机制的研究。特别地，本发明涉及模拟禽体内肠的肠样体培养物。还提供了肠样体培养物研究例如细胞生物学、宿主-病原体相互作用、食品科学和药物的用途。

背景

哺乳动物三维(3D)类器官反映了体内组织的组织，是调查肠细胞生物学和宿主-病原体相互作用的有力工具。已经在各种哺乳动物物种中发展了从哺乳动物成体干细胞中不断扩增生长的自我组织肠类器官或肠样体的专业知识。通过分离肠隐窝或单个多能成体干细胞，将它们嵌入凝胶支架(通常是称为基质胶(Matrigel)的Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤提取物)并添加外部确定的生长因子；表皮生长因子(EGF)、R-spondin和头蛋白，可以生成哺乳动物3D肠样体，该3D肠样体有有组织的隐窝和绒毛结构域、高度极化的上皮、功能性腔室并含有所有正常比例的分化细胞类型。隐窝进入内层是所有绒毛谱系的成熟上皮细胞的中央腔室，该成熟上皮细胞顶端刷状缘结构域面向腔室内。相反，基底外侧表面与细胞外基质(ECM)支架接触。

鼠培养系统已用于其他哺乳动物，但需要额外的生态位因子(niche factor)来概括干细胞自我更新和分化层次，该生态位因子包括Wnt3a、烟酰胺、分子抑制剂间变性淋巴瘤激酶(TGF-β抑制剂)和p38丝裂原活化蛋白(MAP)激酶抑制剂。

Co等人(Cell Reports(2019)26,2509-2520)提供了具有基底细胞表面的人和鼠肠样体，当在补充有ECM蛋白的凝胶支架中生长时，该基底细胞表面朝外，但当细胞构建体随后从支持凝胶支架中回收、转移并在悬浮液中培养时，顶端表面朝外展示证明了这些肠样体逆转了它们的极性。细胞外基质蛋白已被识别为这种上皮极性变化的关键调节因子之一。漂浮的鼠类隐窝迅速解离成杂乱无章的细胞团块，这可能是由于整联蛋白信号传导通过基底膜附着丢失导致。细胞构建体的解离限制了这些构建体作为模型系统的功用。

Powell等人(Biology Open(2017)6 698-705)讨论了来自各种大型农场和小型伴侣动物的肠类器官的繁殖。虽然这在所提供的肠样体中列出了鸡肠样体，但很明显，使用本文教导的基质胶和标准生长因子Wnt3a、R-spondin-3和头蛋白(WRN)的哺乳动物方法的用途导致提供球状体而不是肠样体。Pierzchalska等人(Methods in Molecular Biology(2019)1576:135-144)表明，在发育的最后三天从胚胎鸡胎中分离的肠上皮可用于建立肠类器官的3D培养物。然而，在本文讨论的方法中，当上皮组织的碎片嵌入细胞培养插入物的基质胶基质中时，观察到被上皮细胞覆盖的空球状体的形成。这种方法不会或很少形成类似于哺乳动物肠样体的隐窝绒毛结构，而是形成球状体而不是肠样体。

类器官很容易缩小单细胞培养和体内研究之间的差距，其由与组织和起源物种互补的上皮组成，适用于与细胞系相同的分析技术，并且可以进行基因操作。肠哺乳动物类器官的3D几何形状和内腔的实际限制是它们无法轻松接近顶端上皮。为确保与感染的自然部位相互作用，测试的病原体或任何其他试剂必须是；显微注射到肠样体腔室中，在传代过程中添加到解离的细胞中或必须开发2D肠样体模型。

尽管哺乳动物肠样体成功生长，禽肠样体的生产迄今为止产生的结果有限。使用对其他物种成功的微环境的方法导致薄壁结构没有明确的隐窝和绒毛样结构域，并且这些结构与在体内肠中发现的分化细胞的形态或阵列不同。

发明概述