[发明专利]用于转化真菌孢子的方法

说明书

本发明提供用于将多核苷酸分子引入真菌孢子的方法，其包括使真菌孢子和携带多核苷酸的磁性纳米粒子的混合物暴露于磁体和/或磁场。本发明还提供用于转化真菌的方法，其包括本文公开的方法步骤的步骤，并允许所述多核苷酸分子整合到所述孢子的基因组中，从而转化孢子。本发明还提供用于将核酸递送到真菌孢子的系统，其包含装载有核酸的磁性纳米粒子；用于利用多核苷酸转化真菌孢子的试剂盒，其包含装载有多核苷酸的MNP和真菌孢子；以及包含装载有核酸分子的MNP和真菌孢子的组合物。

技术领域

本发明涉及真菌孢子的转化。

发明概述

真菌是优良的细胞工厂，在许多有用的复杂化合物的生产中有着广泛的应用。它们可以在简单廉价的培养基中快速生长。遗传转化技术允许对真菌基因组进行遗传修饰。由于真核生物真菌含有较大的基因组，因此可以用较大的构建体进行转化，其产物通常比来自细菌的产物更适合人类使用。真菌的转化不仅允许研究真菌的代谢，还允许插入新的遗传元件和修饰内源基因。因此，真菌的转化是开发用于生物技术方法的新的真菌菌株的关键步骤。对于至少在培养基中培养的所有真菌物种，应可能转化真菌(Fincham,Microbiol Rev.1989年3月；53(1):148–170)。

已知真菌遗传转化的许多一般方法，包括原生质体介导转化、农杆菌介导转化、电穿孔、生物射弹法和冲击波介导转化(Li,D.,Tang,Y.,Lin,J.等人，Microb Cell Fact 16,168(2017))

因此，尽管本领域已知许多真菌转化方法，但许多真菌难以用这些方法进行转化，并且这些方法通常耗时且不是非常有效。

鉴于上述情况，本发明提供用于转化真菌孢子的新组合物和新方法。

因此，本发明提供用于将多核苷酸分子引入真菌孢子的方法，其包括使真菌孢子和携带多核苷酸的磁性纳米粒子的混合物暴露于磁体和/或磁场。

此外，本发明提供用于将多核苷酸分子引入真菌孢子的方法，其包括以下步骤：

a.将要转移入孢子的多核苷酸分子装载在磁性纳米粒子(MNP)上，和

b.将装载在所述磁性纳米粒子上的所述多核苷酸分子(DNA-MNP)加至所述孢子，和

c.使混合物暴露于磁力，例如磁体和/或磁场，

d.在所述磁体存在下孵育混合物，以允许将多核苷酸分子引入所述孢子，

从而将多核苷酸分子引入所述孢子。

本发明还提供用于转化真菌的方法，其包括本文公开的方法步骤的步骤，并允许将所述多核苷酸分子整合入所述孢子的基因组，从而转化孢子。

本发明还提供用于将核酸递送到真菌孢子的包含装载有核酸的磁性纳米粒子的系统，以及用于利用多核苷酸转化真菌孢子的包含装载有多核苷酸的MNP和真菌孢子的试剂盒，以及包含装载有核酸分子的MNP和真菌孢子的组合物。

发明详述

将遗传物质递送入靶细胞是操纵或改变细胞中核酸活性的有力工具。在靶细胞中引入DNA的一种成熟方法是电穿孔法。如US2008075701中概述，电穿孔法有两个主要致命缺点：低递送率和低细胞存活率。

用于将遗传物质递送入靶细胞的一种相对较新的方法是磁转染。对于磁转染，将遗传物质装载在包被有阳离子分子的磁性纳米粒子(MNP)上。然后，在外部磁场的影响下，磁性颗粒-遗传物质复合物转运入细胞。许多报告已经证明，磁转染无毒、高效且多用途(US2008075701)。

在磁转染中，缀合的磁性纳米粒子(MNP)与靶分子(如核酸)结合，然后对分子结合的MNP施加磁场，故意将颗粒引入并浓缩到一个或多个靶细胞中。然后核酸可以通过多种不同的机制释放到细胞的细胞质中。