[发明专利]用于在靶向核酸序列处产生多样性的组合物和方法

权利要求书

1.一种在靶核酸分子中诱导靶向修饰的方法，所述方法包括使所述靶核酸分子与以下各项接触：

(a)催化失活的指导核酸酶；和

(b)至少一种诱变剂，

其中在所述靶核酸分子中诱导至少一种修饰。

2.一种在靶核酸分子中诱导靶向修饰的方法，所述方法包括使所述靶核酸分子与以下各项接触：

(a)催化失活的指导核酸酶；

(b)至少一种指导核酸，其中所述至少一种指导核酸与所述催化失活的指导核酸酶形成复合物，并且其中所述至少一种指导核酸与所述靶核酸分子杂交；和

(c)至少一种诱变剂，

其中所述靶核酸分子包含前间区序列邻近基序(PAM)位点，并且其中在所述靶核酸分子中在所述PAM位点的100个核苷酸内诱导至少一种修饰。

3.一种增加核酸分子的靶向区域中的突变率的方法，所述方法包括使所述靶核酸分子与以下各项接触：

(a)催化失活的指导核酸酶；

(b)至少一种指导核酸，其中所述至少一种指导核酸与所述催化失活的指导核酸酶形成复合物，并且其中所述至少一种指导核酸与所述靶核酸分子杂交；和

(c)至少一种诱变剂，

其中所述靶核酸分子包含前间区序列邻近基序(PAM)位点，并且其中与非靶向核酸分子相比，所述核酸分子的所述靶向区域中的突变率增加。

4.一种增加植物基因组内的核酸分子的靶区域中的等位基因多样性的方法，所述方法包括向所述植物提供：

(a)催化失活的指导核酸酶或编码所述催化失活的指导核酸酶的核酸；

(b)至少一种指导核酸或编码所述至少一种指导核酸的核酸，其中所述至少一种指导核酸与所述催化失活的指导核酸酶形成复合物，并且其中所述至少一种指导核酸与所述核酸分子杂交；和

(c)至少一种诱变剂，

其中所述核酸包含邻近于所述靶向区域的前间区序列邻近基序(PAM)位点，并且其中所述核酸分子的所述靶区域的等位基因多样性增加。

5.一种提供具有改进的农艺特征的植物的方法，所述方法包括：

(a)向第一植物提供：

(i)催化失活的指导核酸酶或编码所述催化失活的指导核酸酶的核酸；

(ii)至少一种指导核酸或编码所述指导核酸的核酸，其中所述至少一种指导核酸与所述催化失活的指导核酸酶形成复合物，其中所述至少一种指导核酸与所述植物基因组中的靶核酸分子杂交，并且其中所述靶核酸分子包含前间区序列邻近基序(PAM)位点；和

(iii)至少一种诱变剂；

其中在所述靶核酸分子中诱导至少一种修饰；

(b)从所述第一植物产生至少一种子代植物；以及

(c)选择包含所述至少一种修饰和所述改进的农艺特征的至少一种子代植物。

6.一种用于在靶核酸中诱导靶向修饰的试剂盒，所述试剂盒包含：

(a)催化失活的指导核酸酶或编码所述催化失活的指导核酸酶的核酸；和

(b)至少一种化学诱变剂。

7.如权利要求1所述的方法或如权利要求6所述的试剂盒，其中所述方法或试剂盒还包含(c)至少一种指导核酸或编码所述至少一种指导核酸的核酸，其中所述至少一种指导核酸与所述催化失活的指导核酸酶形成复合物，并且其中所述至少一种指导核酸与所述靶核酸分子杂交。

8.如权利要求1-5中任一项所述的方法或如权利要求6所述的试剂盒，其中所述催化失活的指导核酸酶包含DNA结合结构域。

9.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述靶核酸分子位于细胞中。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述细胞是大肠杆菌细胞。

11.如权利要求9所述的方法，其中所述细胞是植物细胞或动物细胞。