[发明专利]通过使用聚合酶连接区域的引物和分析法

说明书

特定的正向引物和反向引物可用于将同一大小的DNA分子的远距离区域连接成较小的DNA分子。反向引物R1可以具有与区域A的终止序列互补的第一部分，并且可以包含具有重叠序列的第二部分。正向引物F2可以具有与区域B的起始序列互补的第一部分，其中正向引物包括与重叠序列互补的互补重叠序列(例如，相同的第一部分或第二部分)。F2的第一部分可以是整个引物。较小的DNA分子可用于确定区域的单倍型。还描述了包括特定正向引物和反向引物的试剂盒。

背景技术

人类的每条染色体都有两份复本，分别来自父母。理解同一亲本染色体上的变异组合(即单倍型)可以提供有价值的临床意义。特别是，单倍型信息有助于单基因疾病的无创产前检测和破译胎儿的基因组遗传(Hui等人，《临床化学》(Clin Chem.)2017；63:513-524；Lo等人，《科学转化医学》(Sci Transl Med.)2010；2:61ra91)。然而，目前用于确定特定个体的单倍型的技术成本高、准确度低且通量低。

发明内容

使用高通量聚合酶的PCR分析法可用于将同一大DNA分子的远距离区域(例如，相隔100bp至100kbp)连接成较小的DNA分子，因此可更容易地测量这两个区域的单倍型。高通量聚合酶仅可以在双链DNA的每条链的一端添加一个额外的核苷酸(例如，3'末端的A)。这可能会排除或导致产生较小的连接DNA分子(也称为延伸扩增子)的低产量。

为了解决这些问题，可以使用特定的正向和反向引物。例如，反向引物R1可以具有与区域A的终止序列互补的第一部分，并且可以包含具有重叠序列的第二部分。正向引物F2可以具有与区域B的起始序列互补的第一部分，其中正向引物包括与重叠序列互补的互补重叠序列(例如，相同的第一部分或第二部分)。F2的第一部分可以是整个引物。

参考以下详细描述和附图，可以对本公开实施方式的性质和优点进行更好的理解。

术语

如本文中所使用，术语“片段”(例如DNA片段)可以指聚核苷酸或多肽序列中包含至少3个连续核苷酸的部分。核酸片段可以保留亲本多肽的生物活性和/或一些特征。核酸片段可以是双股或单股、甲基化或未甲基化、完整或切割、与其它大分子(例如脂质粒子、蛋白质)复合或未复合的。片段可以源自特定的组织类型，例如胎儿、肿瘤、移植器官等。

术语“分析法”通常是指用于测定核酸性质的技术。分析法(例如第一分析法或第二分析法)通常是指用于测定以下的技术：样品中的核酸数量、样品中核酸的基因组标识、样品中核酸的复本数变异、样品中核酸的甲基化状态、样品中核酸的片段尺寸分布、样品中核酸的突变状况或样品中核酸的片段化模式。所属领域的技术人员已知的任何分析法都可以用于检测任一种本文中提及的核酸特性。分析法也可以指将DNA分子不同区域的扩增产物连接起来以形成一个或多个DNA分子的技术。核酸的特性包括序列、数量、基因组标识、复本数、一个或多个核苷酸位置处的甲基化状态、核酸尺寸、一个或多个核苷酸位置处核酸中的突变以及核酸的片段化模式(例如核酸分段的核苷酸位置)。术语“分析法”可以与术语“方法”互换使用。分析法或方法可以具有具体灵敏度和/或特异性，并且可以使用ROC-AUC统计来测量其作为诊断工具的相对有效性。

“序列读段”是指从核酸分子的任何部分或全部测序的核苷酸串。例如，序列读段可以是存在于生物样品中的完整核酸片段。同样作为一个示例，序列读段可以是从核酸片段测序的短核苷酸串(例如，20-150个碱基)、核酸片段的一端或两端处的短核苷酸串或对存在于生物样品中的整个核酸片段进行的测序。配对的序列读段可与参考基因组进行比对，这可以提供片段的长度。序列读段可以通过多种方式获得，例如使用测序技术或使用探针，例如通过杂交阵列或捕获探针或扩增技术，如聚合酶链反应(PCR)或使用单引物的线性扩增或等温扩增，或基于生物物理测量，例如质谱分析。可以从单分子测序获得序列读段。“单分子测序”是指对单个模板DNA分子进行测序以获得序列读段，而无需解释来自模板DNA分子的克隆复本的碱基序列信息。单分子测序可以对整个分子或仅部分DNA分子进行测序。可以对大多数DNA分子进行测序，例如，大于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。