[发明专利]使用iPS细胞生产成骨细胞构建体的方法

权利要求书

1.一种由iPS细胞生产成骨细胞构建体的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)通过使未分化的iPS细胞接受非贴壁培养来诱导形成胚状体；

(2)通过使步骤(1)中获得的iPS细胞的胚状体接受非贴壁培养来诱导iPS细胞分化为中胚层细胞；和

(3)通过使步骤(2)中获得的iPS细胞的中胚层细胞接受非贴壁培养来诱导分化为成骨细胞，

其中，步骤(1)和(2)均使用包括底面和垂直布置在底面上的环状侧壁的培养容器进行，该底面具有彼此独立布置的多个凹部。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多个凹部中的至少一个具有200μm至900μm的圆当量直径和200μm至1000μm的深度。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多个凹部中的每个均具有近圆形形状的开口。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述iPS细胞为人类iPS细胞或小鼠iPS细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤(1)的培养时间为0.625天至3.5天。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中的培养在选自Wnt信号激活剂和刺猬信号抑制剂中的至少一种的存在下进行。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述Wnt信号激活剂为选自CHIR99021、6-溴靛玉红-3’-肟、肯帕罗酮、SB-216763、SKL2001、脱氧胆酸、WAY-316606、NSC-693868、蓖麻碱、7-氧代-β-谷甾醇、IM-12、HLY78和视黄酸中的至少一种。

8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述刺猬信号抑制剂为选自环巴胺、AY9944、GANT58、GANT61、蒜藜芦碱、SANT-1、SANT-2、U18666A、藜芦胺、维莫德吉、Cur-61414、robotnikinin、JK184和HPI-4中的至少一种。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(3)的培养在选自缺氧模拟化合物和他汀类化合物中的至少一种的存在下进行。

10.根据权利要求1所述的方法，在步骤(1)之前，所述方法进一步包括，不使用饲养细胞而培养未分化的iPS细胞的步骤。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，通过将具有1.5×10⁵细胞/ml至3.5×10⁵细胞/ml的细胞浓度的未分化的iPS细胞的悬浮液置于培养容器中，并随后进行培养来实施步骤(1)。

12.根据权利要求11所述的方法，

其中，采用具有至少一个孔的培养容器来实施步骤(2)，并且

其中，通过将对应于含有步骤(2)获得的中胚层细胞的1至10孔的培养液置于培养容器中，并随后进行培养来实施步骤(3)。

13.根据权利要求1所述的方法，

其中，步骤(1)的培养在ROCK抑制剂的存在下进行；并且

其中，步骤(2)和步骤(3)中的每个培养均在视黄酸的存在下进行。

14.一种由权利要求1所述的方法获得的成骨细胞构建体，所述成骨细胞构建体源自人类iPS细胞且具有1mm至4mm的Feret's直径。