[发明专利]鉴定功能元件的方法

权利要求书

1.一种用于鉴定基因组序列的功能元件的文库，包含多个CRISPR-Cas系统指导RNA，所述指导RNA包含能够靶向至少一个连续基因组区域内的多个基因组序列的指导序列，其中所述指导RNA靶向至少100个基因组序列，所述基因组序列包含所述连续基因组区域内每1000个碱基对的PAM序列上游的非重叠切割位点。

2.权利要求1的文库，其中所述文库包含靶向所述连续基因组区域内每个PAM序列上游的基因组序列的指导RNA。

3.权利要求1或2的文库，其中将每个指导RNA设计成影响DSB位点周围约10bp。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的文库，其中所述PAM序列对至少一种Cas蛋白是特异性的。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的文库，其中基于对至少一种Cas蛋白特异性的多于一个PAM序列，选择所述CRISPR-Cas系统指导RNA。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的文库，其中所述靶向导致所述连续基因组区域的NHEJ。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的文库，其中通过所述多个CRISPR-Cas系统指导RNA内的至少一个指导RNA的所述靶向改变细胞表型，和/或增加或减少基因的转录和/或表达。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的文库，其是质粒文库或病毒文库。

9.根据权利要求1至7中任一项所述的文库，其是载体文库或宿主细胞文库。

10.一种用于鉴定基因组序列的功能元件的方法，包括：

(a)将前述权利要求中任一项所述的文库引入适合于含有至少一种Cas蛋白的细胞群体中，其中所述群体的每个细胞含有不超过一个指导RNA；

(b)基于细胞表型的改变将所述细胞分选成至少两组；

(c)确定每组中存在的指导RNA的相对表示，由此通过每组中存在的指导RNA的表示确定与所述细胞表型的改变相关的基因组位点；

(d)扩增被靶向的一个或多个基因的一个或多个cDNA或DNA序列用于测序；

(e)将测序读段映射到所述靶基因的参考序列；

(f)过滤所述读段以保留仅携带错义突变或框内缺失的那些读段；和

(g)通过应用生物信息学流程确定每种氨基酸或核苷酸对所述细胞表型的权重。

11.权利要求10的方法，其中所述细胞表型的改变选自下组：功能丧失、功能获得、基因转录减少、基因转录增加、基因表达减少和基因表达增加。

12.权利要求10或11的方法，其中所述基因组序列用于编码功能蛋白。

13.权利要求12的方法，其用于在单个氨基酸分辨率鉴定所述蛋白质的功能元件。

14.权利要求10或11所述的方法，其中所述基因组序列用于编码非编码RNA或基因调控元件。

15.权利要求14的方法，其中所述基因调控元件为启动子或增强子。

16.权利要求10-15中任一项的方法，其中所述鉴定处于天然生物背景中。