[发明专利]用于生物聚合物测序的装置，方法和化学试剂

说明书

本发明提供了构建基于体外模板定向酶促复制或合成的用于生物分子测序的系统的方法。本发明的实施方式涉及使用电信号对生物聚合物进行测序和鉴定的系统、方法、装置和组合物。更具体地，本公开包括基于酶活(包括复制)教导构建系统以电子方式检测生物聚合物的实施方式。

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年1月18日提交的美国临时申请系列号62/794,096的优先权，其完整公开通过引用方式纳入本文。

技术领域

本发明的实施方式涉及利用电子信号测序或鉴定生物聚合物的系统、方法、装置、和组合物。更具体地，本公开包括基于酶活(包括复制)教导构建系统以电子方式检测生物聚合物的实施方式。本发明中的生物聚合物包括但不限于天然或合成的DNA、RNA、DNA寡核苷酸、蛋白质、肽、多糖等。酶包括但不限于天然的、突变的或合成的DNA聚合酶、RNA聚合酶、DNA解旋酶、DNA连接酶、DNA外切核酸酶、逆转录酶、RNA引物酶、核糖体、蔗糖酶、乳糖酶等。在下文中，主要讨论并使用DNA和DNA聚合酶以说明本发明概念。

发明背景

通过酶促合成进行DNA测序可以追溯到桑格的链终止法，该方法在靶序列的体外复制期间通过DNA聚合酶把双脱氧核苷酸选择性地纳入DNA中。¹_,²这种酶促方法已经以高通量或实时方式扩展到下一代测序(NGS)。^3,4尽管NGS已经将人类基因组测序的成本降低到$1000的范围，但最近的数据显示成本的降低可能已经达到了最低水平(https://www.genome.gov/27565109/the-cost-of-sequencing-a-human-genome)。限制因素之一是NGS依赖于荧光检测，这需要笨重且昂贵的精密仪器。

无标记检测刺激了聚合酶对DNA合成的电子读取⁵，该检测已经被开发为可用于基因组测序的产品。⁶最近的进展表明电子方法可以开发为手持设备，例如MinION测序仪(www.nanoporetech.com)，其可测量通过蛋白质纳米孔的离子电流变化进行DNA测序，其中DNA解旋酶用于控制DNA通过纳米孔的易位。⁷然而，蛋白质纳米孔只能实现低测序准确度(单次读取85％⁸)。Gundlach及其同事已经证明，由耻垢分枝杆菌孔蛋白A(称为MspA)构成的蛋白质纳米孔中的离子电流阻塞是四个核苷酸(四聚体)的集合事件，因此有4⁴(即256)种可能的四聚体产生大量的冗余电流水平。^9,10由于离子电流受到纳米孔内核苷酸之外的核苷酸的影响，¹¹用于测序的原子级薄纳米孔的概念可能无法实现单核苷酸分辨率。

Collins及其同事报道了一种单壁碳纳米管(WCNT)场效应晶体管(FET)装置，其上系有DNA聚合酶I的Klenow片段以监测其DNA合成。^12,13在该装置中，当核苷酸被纳入DNA链时，记录了低于平均基线电流的ΔI(t)的短暂偏移。酶纳入不同的核苷酸会导致ΔI的差异。该技术有可能用于DNA测序。碳纳米管是一种仅由锁定在六边形网格中的单层碳原子制成的材料。由于刚性的化学结构，它的感应可能依赖于靠近蛋白质附接位点的带电侧链的静电门控运动。然而，该装置中的碳纳米管长度为0.5–1.0μm，¹⁴这对在其上可重复地安装单个蛋白质分子提出了挑战。在现有技术中，该发明(WO2017/024049)提供了用于DNA测序的纳米级场效应晶体管(nanoFET)，其中DNA聚合酶被固定，其核苷酸出口区域朝向碳纳米管栅极，它还提供了一组聚磷酸盐标记的核苷酸，用于鉴定纳入的核苷酸(图1)。