[发明专利]用于快速扩增的突变型Taq聚合酶

说明书

本发明包括一种突变型Taq聚合酶，该突变型Taq聚合酶可以在时间被限制到少至一秒钟的延伸条件下显著地延伸和扩增靶序列。所述突变型Taq聚合酶或其生物活性片段具有表I所示的区别于野生型的一种或多种取代。

序列表

本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表，在此通过引用将其全部内容并入本文。上述ASCII副本创建于2020年2月27日，名为Abclonal-Fast_SL.txt，大小为2,224,491字节。

背景技术

在用于DNA扩增的聚合酶链式反应(PCR)过程中，将靶标-引物-聚合酶-dNTP-缓冲液混合物在不同温度下连续加热循环反应，使靶标DNA链去退火(通常在约90-99℃下进行)，引物-靶标DNA链退火(通常在约40-70℃下进行)，以及DNA聚合酶介导的引物延伸(通常在约50-72℃下进行)，从而产生新的互补的扩增子链。反应过程可包括多达25-45个循环以产生足够的扩增。

PCR通常使用热稳定的DNA聚合酶进行，这些酶可以抵挡与去退火相关联的高温而不会因蛋白热变性而失活。

提高PCR速度可具有显著的商业优势，扩增的样品可以更快速地生成，冷热循环反应周期更少。现有的Taq聚合酶以有限的速率延伸引物。

因此，明显需要能够实现提高速度的PCR扩增的热稳定的DNA聚合酶。

发明内容

本发明包括具有与野生型相异的一个或多个点突变的突变型Taq聚合酶(SEQ IDNO：4显示带有C末端His标记的核苷酸野生型序列；SEQ ID NO：5显示野生型氨基酸序列)，具有如下表I所示的一个或多个氨基酸点取代(在以下位点的一个或多个位点处)：

本发明还包括具有以上显示的一个或多个氨基酸位点取代的突变型Taq聚合酶，其中Taq聚合酶序列的剩余部分与野生型Taq聚合酶具有至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少99％的同一性。

本发明还包括编码上述任何突变型Taq聚合酶的核酸序列，包括序列表中的相应序列，以及编码上述或序列表中列出的任何突变型Taq聚合酶的氨基酸序列的所有简并核酸序列；以及含有该核酸序列的载体和经该核酸序列转化并能表达上述突变型Taq聚合酶的细胞。

本发明还包括包含上述突变型Taq聚合酶的任何一种的组合物或试剂盒、编码它们的核酸序列或包含该核酸序列的载体。本发明还包括一种扩增目标核酸的方法，其中将上述突变型Taq聚合酶中的任何一种设计用于扩增目标核酸的反应混合物中，并使该反应混合物处于扩增目标核酸的条件中。

上述突变型Taq聚合酶比野生型能更快速地扩增靶标DNA序列，如以下实施例和附图中的结果所示。

附图说明

图1显示若干凝胶的合并图像，各图像代表使用突变型Taq聚合酶之一进行PCR反应后的结果。“WT”代表野生型(SEQ ID NO 4和5)。各突变以数字或数字加字母命名，对应于表格I所列的突变位点和序列之一。所有突变位点和相应序列列于下方，顺序显示于图1中。各凝胶电泳图显示了扩增含有序列SEQ ID NO:1的目标核酸后，进行凝胶电泳将扩增产物分离的结果。各凝胶显示两个泳道，因为对各突变体设置平行重复，然后将结果整合到图1的合并凝胶中。