[发明专利]无毒CAS9酶及其应用

权利要求书

1.一种方法，其包括将第一载体引入多个细胞中，其中所述第一载体编码融合蛋白复合物，所述融合蛋白复合物包含与外切核酸酶融合的Cas9核酸酶；

其中包含所述载体的所述多个细胞的活力是包含编码Cas9核酸酶的第二载体的第二多个细胞的活力的至少1.5倍；

其中所述第二多个细胞是用所述第二载体转染的K562细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一载体编码所述融合蛋白复合物和gRNA。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述外切核酸酶选自MRE11、EXOl、EXOIII、EXOVII、EXOT、DNA2、CtIP、TREX1、TREX2、Apollo、RecE、RecJ、T5、Lexo、RecBCD和Mungbean。

4.如权利要求2所述的方法，其中将供体多核苷酸引入到所述多个细胞中。

5.如权利要求4所述的方法，其中通过与外切核酸酶融合的所述Cas9对基因的异常基因座进行编辑。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述供体多核苷酸包含还含有所述基因的功能性基因座的整合盒。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述活力通过刃天青测定来测量。

8.如权利要求3所述的方法，其中所述外切核酸酶是ExoI。

9.如权利要求5所述的方法，其中所述异常基因座是HBB基因的异常基因座。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述供体多核苷酸编码所述HBB基因的功能性基因座。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述融合蛋白复合物编码至少一个核定位信号(NLS)。

12.如权利要求1所述的方法，其中编码所述融合蛋白复合物的所述第一载体与SEQ IDNO:2-18中的任一个具有至少80％序列同一性。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述第一载体通过电穿孔递送。

14.如权利要求4所述的方法，其中所述供体多核苷酸包含位于紧邻切割位点的3’末端的突变前间区序列邻近基序(PAM)序列，其中所述突变PAM序列包含5’-NCG-3’或5’-NGC-3’。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述融合蛋白复合物不能切割所述突变PAM序列。

16.如权利要求4所述的方法，其中所述供体多核苷酸是单链DNA。

17.如权利要求4所述的方法，其中所述供体多核苷酸是双链DNA。

18.一种多肽，其包含第一功能片段、包含Cas核酸酶的第二功能片段和接头肽，其中：

所述第一功能片段与所述接头肽的第一末端偶联，并且所述第二功能片段与所述接头肽的第二末端偶联；和

当将包含所述多肽和核糖核酸(RNA)分子的第一复合物施用于第一多个细胞时，与将包含Cas9核酸酶和所述RNA分子的第二复合物施用于第二多个细胞时在所述第二多个细胞中观察到的毒性相比，在所述第一多个细胞中观察到降低的毒性。

19.如权利要求18所述的多肽，其中所述第一功能片段包含外切核酸酶，其中所述外切核酸酶选自MRE11、EXOl、EXOIII、EXOVII、EXOT、DNA2、CtIP、TREX1、TREX2、Apollo、RecE、RecJ、T5、Lexo、RecBCD和Mungbean。