[发明专利]用于多重拷贝数变异检测和等位基因比率定量的定量扩增子测序

权利要求书

1.一种用于制备用于高通量测序的基因组DNA的靶定区域的方法，所述方法包括：

(a)获取基因组DNA样品；

(b)通过使用如下项进行两个PCR循环来扩增所述基因组DNA样品的至少一部分：

(i)第一寡核苷酸，其从5′到3′包括第一区域、长度为0至50个核苷酸的第二区域、包含至少四个简并核苷酸的第三区域、和包含与第一靶标基因组DNA区域互补的序列的第四区域；和

(ii)第二寡核苷酸，其从5′到3′包括第五区域、长度为0至50个核苷酸的第六区域、和包含与第二靶标基因组DNA区域互补的序列的第七区域；

(c)使用比步骤(b)中所使用的退火温度高0-10℃的退火温度，并使用如下项进行至少三个PCR循环来扩增步骤(b)的产物：

(i)第三寡核苷酸，其包括能够与所述第一区域的至少一部分的反向互补序列杂交的序列；和

(ii)第四寡核苷酸，其包括能够与所述第五区域的至少一部分的反向互补序列杂交的序列；以及

(d)通过使用第五寡核苷酸进行至少一个PCR循环来扩增步骤(c)的产物，所述第五寡核苷酸从5′到3′包括第八区域、长度为0至50个核苷酸的第九区域、和包含与第三靶标基因组DNA区域互补的序列的第十区域，其中所述第三靶标基因组DNA区域比所述第二靶标基因组DNA区域更靠近所述第一靶标基因组DNA区域至少一个核苷酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法是用于制备用于高通量测序的基因组DNA的1至10,000个靶定区域的方法。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第三区域是唯一分子标识符(UMI)。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述第三靶标基因组DNA区域比所述第二靶标基因组DNA区域更靠近所述第一靶标基因组DNA区域1-10个碱基。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述第一区域和所述第八区域是通用引物结合位点。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述第一区域和所述第八区域包含完整或部分NGS衔接子序列。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述第五区域包含在人类基因组中找不到的序列。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述第五区域包含不同于NGS衔接子序列的序列。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述第一区域和所述第五区域的解链温度比所述第四区域和所述第七区域的解链温度高0-10℃。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述第三区域中的所述简并核苷酸各自独立地为A、T或C之一。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述第三区域中的所述简并核苷酸均不是G。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中存在各自具有唯一第三区域的第一寡核苷酸群体。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其进一步包括纯化步骤(c)的所述产物。

14.根据权利要求13所述的方法，其中纯化包括SPRI纯化或柱纯化。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其进一步包括纯化步骤(d)的所述产物。

16.根据权利要求15所述的方法，其中纯化包括SPRI纯化或柱纯化。