[发明专利]生产功能化单链寡核苷酸的方法和产品

权利要求书

1.一种生产功能化单链寡核苷酸的方法，所述方法包括：

(a)提供环状DNA分子，所述环状DNA分子包含与裂解结构域邻接的寡核苷酸序列；

(b)以(a)的环状DNA分子为模板，用一种以上功能化核苷酸(dNTP)进行滚环扩增(RCA)反应；和

(c)在裂解结构域酶促裂解RCA反应的产物，释放功能化单链寡核苷酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述环状DNA分子是双链的，所述方法还包括如下附加步骤：在进行RCA反应之前裂解环状DNA分子的单链以提供RCA模板。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述功能化dNTP选自：包含炔基的核苷酸、荧光标记的核苷酸、包含甾醇基团的核苷酸、包含聚醚基团的核苷酸、包含金属络合物的核苷酸、包含乙烯基的核苷酸、包含硫醇基团的核苷酸、硫代核苷酸、经修饰具有增加的核酸酶抗性的核苷酸、包含能够参与点击化学反应的化学基团的核苷酸，和影响寡核苷酸热稳定性的核苷酸。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述功能化dNTP是包含炔基、烯烃基、叠氮基、卤素基团、O-甲基、锁核糖的核苷酸，优选地，所述功能化dNTP是包含炔基、乙烯基或叠氮基的核苷酸。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述方法还包括通过炔基、乙烯基或叠氮基将分子或组分与寡核苷酸缀合的步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述分子或组分选自：荧光基团、甾醇、聚醚、金属络合物、含有硫醇基团的分子、含有提供增加核酸酶抗性的基团的分子，和包含能够参与点击化学反应的基团的分子。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述裂解结构域与所述寡核苷酸序列直接相邻。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述裂解结构域包含被裂解酶识别的序列。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述裂解结构域包含能够形成发夹结构的序列或由能够形成发夹结构的序列组成。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述发夹结构的双链部分包含被裂解酶识别的序列。

11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中，所述裂解酶是II型限制性核酸内切酶，任选地是IIS型限制性核酸内切酶，例如BseGI或BtsCI。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，与寡核苷酸序列邻接的裂解结构域是相同的。

13.根据权利要求2至12中任一项所述的方法，其中，所述裂解环状DNA分子的单链以提供RCA模板的步骤包括用裂解酶裂解环状DNA分子的单链。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述的环状DNA分子含有被裂解酶识别的序列。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述被裂解酶识别的序列位于与寡核苷酸序列邻接的裂解结构域之间，且不在寡核苷酸序列中。

16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中，所述裂解酶是切口酶，任选地，所述裂解酶是Nb.BsrDI、Nt.BspQI或它们的组合。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中，所述RCA反应使用phi29 DNA聚合酶。

18.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中，所述RCA反应使用Bst DNA聚合酶。