[发明专利]一种使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法

权利要求书

1.一种使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将含目标序列的单链DNA、聚合酶反应缓冲液、5’末端带修饰的DNA寡核苷酸链的引物混合均匀，得到混合液，然后升温进行去空间结构处理，冷却至室温，得到混合体系1；

(2)往步骤(1)所述混合体系1中加入核糖核苷酸，SFM4-3聚合酶，混合均匀，得到转录体系；

(3)将步骤(2)所述转录体系进行孵育处理，得到转录产物，纯化分离RNA，得到目标序列的5’标记RNA。

2.根据权利要求1所述的使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法，其特征在于，步骤(1)所述聚合酶反应缓冲液包含400-600mM的Tris、400-600mM的MgCl₂、60-70mM的KCl；所述混合液的pH值为8.0-9.0。

3.根据权利要求1所述的使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法，其特征在于，步骤(1)所述5’末端带修饰的DNA寡核苷酸链的引物包括15个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸及修饰部分；所述修饰部分为生物素标记、荧光素标记、放射性标记中的一种以上；在步骤(1)所述混合液中，含目标序列的单链DNA的终浓度为400-600nM，Tris的浓度为40-60mM、MgCl₂的浓度为40-60mM、KCl的浓度为6-7mM，5’末端带修饰的DNA寡核苷酸链的引物的终浓度为400-1200nM。

4.根据权利要求1所述的使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法，其特征在于，步骤(1)所述去空间结构处理的温度为90-98℃，去空间结构处理的时间为2-5min。

5.根据权利要求1所述的使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法，其特征在于，步骤(2)所述核糖核苷酸包括天然的核糖核苷酸和非天然核糖核苷酸中的一种以上；所述天然的核糖核苷酸包括ATP、UTP、GTP、CTP；非天然核糖核苷酸包括糖基2’位修饰的ATP、糖基2’位修饰的UTP、糖基2’位修饰的GTP、糖基2’位修饰的CTP；所述修饰为2’-F、2’-OMe、2’-N₃、2'-Cl、2'-NH₂中的一种以上。

6.根据权利要求5所述的使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法，其特征在于，当使用的核糖核苷酸为天然的核糖核苷酸时，在所述转录体系中，ATP、UTP、GTP、CTP的浓度相同；当使用的核糖核苷酸为非天然的核糖核苷酸时，糖基2’位修饰的ATP、糖基2’位修饰的UTP、糖基2’位修饰的GTP、糖基2’位修饰的CTP的浓度相同。

7.根据权利要求1所述的使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法，其特征在于，步骤(2)所述的SFM4-3聚合酶的序列如SEQ ID NO.1所示；在步骤(2)所述转录体系中，核糖核苷酸的终浓度为0.2-0.6mM，SFM4-3聚合酶的终浓度为0.8-1.6μM。

8.根据权利要求1所述的使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法，其特征在于，步骤(3)所述孵育处理的温度为45-70℃，孵育处理的时间为8-16h。

9.根据权利要求1所述的使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法，其特征在于，步骤(3)所述纯化分离RNA，包括：

将转录产物经过变性胶分离后，切胶回收5’末端带标记的RNA，完成RNA的纯化分离。

10.根据权利要求1所述的使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法，其特征在于，步骤(3)所述5’标记RNA为RNA适配体。