[发明专利]用于筛选治疗器官纤维化的胶原转录抑制剂的高通量筛选方法有效
| 申请号： | 202011638647.9 | 申请日： | 2020-12-31 |
| 公开（公告）号： | CN112813132B | 公开（公告）日： | 2022-08-05 |
| 发明（设计）人： | 王阳;柏旭 | 申请（专利权）人： | 厦门市博瑞来医药科技有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/02 | 分类号： | C12Q1/02;G01N21/64 |
| 代理公司： | 合肥市上嘉专利代理事务所(普通合伙) 34125 | 代理人： | 李璐 |
| 地址： | 361026 福建省厦门市海沧区翁角*** | 国省代码： | 福建;35 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 用于 筛选 治疗 器官 纤维化 胶原 转录 抑制剂 通量 方法 | ||
1.一种用于筛选治疗器官纤维化的胶原转录抑制剂的高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：克隆人Col1A1、Col1A2、Col3A1启动子-2000-100区域，单独插入pGL3-basic报告基因载体，得到3个质粒：pGL3-Col1A1Prom、pGL3-Col1A2Prom 、pGL3-Col3A1Prom，和联合插入pGL3-basic报告基因载体，得到1个质粒pGL3-Col1A1Prom-Col1A2Prom，经转化DH5α菌和质粒提取步骤得到用于转染的质粒；
步骤2：将步骤1中得到的质粒分别与内参pRL-TK质粒转染成纤维细胞，转染6—24h后培养基中加入TGF-β1激活，同时加入待筛选的胶原转录抑制剂；
步骤3：TGF-β1激活24h后，按照荧光素酶报告基因检测试剂盒说明进行处理，酶标仪读取化学发光数据，得出对TGF-β1诱导的胶原合成敏感的质粒及所述待筛选的胶原转录抑制剂对TGF-β1诱导的胶原合成转录抑制的IC50曲线。
2.一种用于筛选治疗器官纤维化的胶原转录抑制剂的高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：克隆人Col1A1、Col1A2、Col3A1启动子-2000-100区域，单独插入pGL3-basic报告基因载体，得到3个质粒：pGL3-Col1A1Prom、pGL3-Col1A2Prom 、pGL3-Col3A1Prom，和联合插入pGL3-basic报告基因载体，得到1个质粒pGL3-Col1A1Prom-Col1A2Prom，经转化DH5α菌和质粒提取步骤得到用于转染的质粒；
步骤2：将步骤1中得到的质粒分别与内参pRL-TK质粒转染成纤维细胞，转染6—24h后培养基中加入TGF-β1激活，同时加入待筛选的胶原转录抑制剂和浓度为0.01nM-10mM的TGFβR抑制剂Galunisertib和SB-431542；
步骤3：TGF-β1激活24h后，按照标准双荧光素酶报告基因检测，酶标仪读取化学发光数据，得出所述待筛选的胶原转录抑制剂对TGF-β1诱导的胶原合成转录抑制的IC50曲线及化合物Galunisertib和SB-431542对TGF-β1诱导的胶原合成转录抑制的IC50曲线。
3.一种利用如权利要求1或2所述用于筛选治疗器官纤维化的胶原转录抑制剂的高通量筛选方法在测定抑制I型或III型胶原转录药物的药效定量分析中的应用。
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