[发明专利]一种用于检测猪圆环病毒3型的引物对、探针、试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了一种用于检测猪圆环病毒3型的引物对、探针、试剂盒及其检测方法。该引物对包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的特异性引物；探针序列如SEQ ID NO.3所示，并在探针的5’端标记有FAM荧光基团。本申请根据猪圆环病毒3型ORF2保守区域设计了一对特异性引物和一条探针，优化实时荧光定量PCR反应条件和体系，建立了能够特异性检测PCV3的荧光定量PCR方法，最低检测值仅为7.87×10¹拷贝/μL，灵敏度高；并且，采用本申请方法检测不同稀释度PCV3标准品的Ct值变异系数均小于1％，表明本申请方法具有很好的重复性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测猪圆环病毒3型的引物对、探针、试剂盒及其检测方法。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是一种小型单股环状无囊膜的DNA病毒，病毒粒子呈二十面体对称，直径仅17～20nm。已知的猪圆环病毒主要包括2个血清型，猪圆环病毒1型(PCV1)对猪无致病性，猪圆环病毒2型(PCV2)能引发多种猪圆环病毒相关疾病。猪圆环病毒3型(PCV3)是一种新型圆环病毒，2016年首次在患有猪皮炎肾病综合征(PDNS)与繁殖障碍的母猪以及其流产胎儿体内被鉴定发现。PCV3基因组全长2000bp，含有2个反向排列的开放阅读框(ORFs)，其中ORF1编码含有296个氨基酸的复制酶蛋白(Rep)，ORF2编码含有241个氨基酸的衣壳蛋白(Cap)。基因分析发现PCV3与PCV2、PCV1基因组之间同源性较低，并且抗原蛋白Cap之间不具有交叉保护性。

自2016年以来，我国部分省(市)相继出现以母猪流产和死亡、断奶仔猪呼吸衰竭和死亡为临床特征的PCV3感染报道，相关研究表明，PCV3已经在我国出现并且流行很长一段时间。PCV3作为近几年发现流行的圆环病毒，常以混合感染的形式出现，给养猪业的疾病防控带来一定困难，快速准确地诊断猪群的感染状态对于预防和控制猪圆环病毒具有十分重要的意义。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种用于检测猪圆环病毒3型的引物对、探针、试剂盒及其检测方法，本申请通过设计针对PCV3 ORF2的特异性引物，探索引物和探针最佳工作浓度，进一步确定最适反应体系及扩增条件，应用荧光定量PCR技术建立了定量检测PCV3的方法，该方法特异性强、重复性好、灵敏度高，为PCV3临床鉴别诊断提供了有力的技术支持。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种用于检测猪圆环病毒3型的引物对，包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的特异性引物。

进一步地，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对用于扩增猪圆环病毒3型的ORF2基因保守区域。

进一步地，采用所述引物对进行PCR检测时，还需使用如SEQ ID NO.3所示的探针。

进一步地，探针为5’端标记有FAM荧光基团的TaqMan MGB探针。

一种用于检测猪圆环病毒3型的试剂盒，包括权利要求1的引物对以及权利要求3的探针。

一种猪圆环病毒3型的检测方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样本DNA；

(2)以步骤(1)所得DNA为模板，采用权利要求1所述引物和权利要求3所述探针对其进行PCR扩增，回收纯化扩增产物后，根据检测结果判断是否含有猪圆环病毒3型。

进一步地，PCR反应体系为：2×Premix Ex Taq^TM 12μL、PCV3-F 1μL、PCV3-R1μL、PCV3-R探针1μL、模板DNA 2.0μL，最后用ddH₂O补充至20μL。