[发明专利]一种野生东北接骨木的组织培养方法

权利要求书

1.一种野生东北接骨木的组织培养方法，其特征在于：所述方法通过以下步骤实现：

步骤一、外植体的选取步骤：

选取东北接骨木的当年生带休眠芽的枝条，经水培后，选取带侧芽的茎段做为外植体；

步骤二、外植体的消毒步骤：

将外植体依次使用酒精和升汞进行消毒，将消毒后的外植体两端各剪去2mm；

步骤三、诱导分化培养的步骤：

将步骤二消毒后的外植体接入初代培养基中培养，形成带芽外植体；其中，

培养条件为：培养温度为20～24℃，光照强度为2000lx，光照时间每天12h，培养30天；

初代培养基的成分包括1/2MS、mg/L 6-BA 4.0、0.2mg/L NAA、6.0g/L琼脂、30g/L蔗糖，初代培养基的pH值为5.8；

步骤四、不定芽增值培养的步骤：

将经步骤三后所得的带芽外植体接入增殖培养基中培养；其中，

培养条件为：培养温度为20～24℃，光照强度为2000lx，光照时间每天12h，培养周期为40天；

增殖培养基的成分包括：改良MS、2.0mg/L 6-BA、0.1mg/LNAA、6.0g/L琼脂、30g/L蔗糖，增殖培养基的pH值为5.8；

步骤五、壮苗培养的步骤：

将经步骤四的增殖培养基中培养成的不定芽逐个切下，并将切下的不定芽接入改良MS培养基中培养；其中，

培养条件为：培养温度为20～24℃，光照强度为2000lx，光照时间每天12h，培养周期为40天；

步骤六、生根培养的步骤：

将经步骤五的MS培养基中培养的芽接入生根培养基中培养，至此完成野生东北接骨木的组织培养；其中，

培养条件为：培养温度为20～24℃，光照强度为2000lx，光照时间为每天12h，培养周期为30天；

生根培养基的组成包括：MS、1.0mg/L 6-BA、0.5mg/L NAA、6.0g/L琼脂、30g/L蔗糖，生根培养基的pH值为5.8。

2.根据权利要求1所述的一种野生东北接骨木的组织培养方法，其特征在于：所述的步骤二中外植体的消毒步骤，具体为：

首先、将外植体用洗涤剂作表面清洗，清除表面的尘土，再将外植体用流水冲洗，放入消毒瓶中；

之后、把装有外植体的消毒瓶用75％的酒精棉擦拭后放入超净工作台，在超净工作台上打开装有外植体的消毒瓶，倒入75％酒精并摇晃消毒瓶，浸泡消毒30s，倒去酒精，用无菌水冲洗外植体3次～5次；

之后、用0.1％HgCl₂浸泡5min，无菌水冲洗4次～5次，并浸泡30min，再用无菌滤纸吸干外植体表面的水分。

3.根据权利要求1或2所述的一种野生东北接骨木的组织培养方法，其特征在于：步骤二中外植体的消毒步骤中，还需确定外植体的尺寸，具体是：

将采集的枝条的侧枝去掉，剪成4～5cm的带芽茎段，置于放有洗衣粉水的烧杯里，用纱布网将烧杯口套住，持续晃动烧杯5min，将盛装茎段的烧杯用流水冲洗1～2h。

4.根据权利要求3所述的一种野生东北接骨木的组织培养方法，其特征在于：所述的步骤三中，初代培养基中蔗糖的浓度为20g/L，所述的琼脂的浓度为6.5g/L，且采用氢氧化钠溶液调节pH值至6.0；

所述的步骤四中，增殖培养基中蔗糖的浓度为20g/L，所述的琼脂的浓度为6.5g/L，且采用氢氧化钠溶液调节pH值至6.0；

所述的步骤五中，MS培养基中蔗糖的浓度为20g/L，所述的琼脂的浓度为6.5g/L，且采用氢氧化钠溶液调节pH值至6.0。

5.根据权利要求1、2或4所述的一种野生东北接骨木的组织培养方法，其特征在于：所述的步骤三的诱导分化培养的步骤中，还需进行预防褐化的处理步骤；

所述的预防褐化的处理步骤具体为，在第一次接种至培养瓶内后，每隔3天换瓶一次，且换瓶次数为三次。