[发明专利]一种用于荧光标记的环丁烯衍生物

说明书

本发明提供了一种用于荧光标记的环丁烯衍生物，以及由该环丁烯衍生物制得的荧光标记试剂盒。该环丁烯衍生物的结构如式I所示。实验表明，本发明提供的环丁烯衍生物具有优异的稳定性，同时在与四嗪类化合物发生生物正交反应时具有快速的反应速度，因此，本发明的环丁烯衍生物在生物正交反应激活前在复杂的生物体系中能够保持良好的稳定性，而且在生物正交反应激活后，能够与带荧光基团的目标蛋白上的四嗪结构快速发生生物正交反应，开启荧光，实现对该目标蛋白的荧光标记。本发明提供的环丁烯衍生物能够用来制备荧光标记试剂盒，发挥荧光标记的作用，在活体追踪、荧光成像等领域具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于生物标记领域，具体涉及一种用于荧光标记的环丁烯衍生物。

背景技术

发展对细胞内的蛋白分子实时可视化的标记方法对于理解生命的分子基础有着重要的意义。对蛋白的标记目前主要使用荧光蛋白、自标记蛋白(比如SNAP标签)、连接酶(比如硫辛酸连接酶和自标记标签(比如四半胱氨酸)等方法。虽然这些方法可以实现快速标记，但是要在所关注的蛋白中引入额外的序列，可能会干扰蛋白的结构和功能，从而对生物学的研究造成很大的影响；此外，将这些探针分子插入到蛋白的任意位置是很有挑战性的。

生物正交反应(Bioorthogonal reaction)是一类在生理条件下能够特异性与目标分子发生的高速、高效的化学反应，被广泛应用于生物分子的定点标记。这类反应可以在生物体内的生理条件下发生，不会与体内同时发生的其他生化反应互相干扰，也不会对生物体和目标生物分子产生损伤。能够发生生物正交反应的这两个反应基团相互之间具有高度的反应活性，同时在生理环境下对周围其它的反应基团是惰性的。随着研究中对时间分辨率的更高要求，基于狄尔斯-桑尔德反应(Diels-Alder反应)机制的四嗪类化合物与亲双烯体的生物正交反应凭借突出的反应速率、正交性、生物相容性，逐渐取代了金属催化的正交反应。因此，借助这类生物正交反应与有机小分子荧光染料，可以实现实时对活细胞内生物大分子的精准标记、成像等。

在目前已知的生物正交反应中，反式环辛烯(TCO)与四嗪的逆电子需求的狄尔斯-阿尔德反应具有极高的反应速率。这种类型的反应最初由Fox教授于2008年首次报道，自此，该类生物正交反应脱颖而出，已成为目前最流行和最有效的生物正交反应。但是，TCO及其相关类似物由于自身高张力原因，很容易在复杂的生物体系中发生双键顺反异构而失活，使得该类型反应不能在拥有较高反应速率的同时保持良好的生物兼容性。而理想的生物正交反应除了要有可控性和较快的反应速率，还需要良好的生物兼容性，以便在生物正交反应激活前能够在复杂的生物体系中保持良好的稳定性。

而且，目前报道的与四嗪类化合物发生Diels-Alder反应的亲双烯体的制备方法成本较高，需要使用重金属催化剂，不合适工业化生产。

因此，开发出一种制备成本低、操作简单的方法，制得同时具有优异的稳定性和快速反应速度的新型亲双烯体，并将其用于与四嗪类化合物发生生物正交反应，在生物标记等领域具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于荧光标记的环丁烯衍生物，以及由该环丁烯衍生物制得的荧光标记试剂盒。

本发明提供了一种式I所示环丁烯衍生物：

其中，X为O或S；

n选自0～3的整数；