[发明专利]一种秀珍菇同核体菌丝鉴定的InDel标记方法在审
| 申请号： | 202011620317.7 | 申请日： | 2020-12-31 |
| 公开（公告）号： | CN112646920A | 公开（公告）日： | 2021-04-13 |
| 发明（设计）人： | 王伟科;沈颖越;闫静;陆娜;宋吉玲;袁卫东;周祖法 | 申请（专利权）人： | 杭州市农业科学研究院 |
| 主分类号： | C12Q1/6895 | 分类号： | C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12Q1/04 |
| 代理公司： | 北京盛凡智荣知识产权代理有限公司 11616 | 代理人： | 邓凌云 |
| 地址： | 310000 浙江省*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 秀珍菇 菌丝 鉴定 indel 标记 方法 | ||
1.一种秀珍菇同核体菌丝鉴定的InDel标记方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)对秀珍菇进行栽培出菇，待秀珍菇L、T和N菌株的子实体进入成熟期后，将子实体置于包含灭菌滤纸条的孢子收集器中；
(2)将收集的孢子置于无菌水中，使用血球计数板对孢子悬浮液进行孢子计数，通过梯度稀释法对孢子悬浮液进行稀释，而后涂布9cm薄PDA平板，置于25℃培养箱中培养；
(3)待孢子刚萌发时，通过20倍显微镜镜检，挑取单个菌落于新的PDA平板上培养，获得秀珍菇单孢分离菌株；
(4)对单孢分离菌株进行培养，采用CTAB法提取单孢分离株的基因组DNA，然后以InDel03-H引物为扩增引物，进行PCR扩增反应，所得PCR产物经电泳检测后，对秀珍菇单孢分离株带型进行区分。
2.根据权利要求1所述的一种秀珍菇同核体菌丝鉴定的InDel标记方法，其特征在于：所述步骤(4)中的电泳检测为将PCR扩增产物，取5μL混合液在1.2％的含绿如蓝DNA染色剂的琼脂糖凝胶上进行电泳。
3.根据权利要求2所述的一种秀珍菇同核体菌丝鉴定的InDel标记方法，其特征在于：所述电泳的电压为120V，电泳时间为20min，在紫外凝胶成像系统上进行拍照。
4.根据权利要求1所述的一种秀珍菇同核体菌丝鉴定的InDel标记方法，其特征在于：所述步骤(4)中的PCR扩增反应的条件为：98℃预变性3min，98℃变性10s，52℃退火5s，68℃延伸1s，共35个循环，68℃补平4min。
5.根据权利要求1所述的一种秀珍菇同核体菌丝鉴定的InDel标记方法，其特征在于：所述步骤(4)中的PCR扩增反应的体系为：总体积为15μL，7.5μL的KODone mixture混合液，待扩增基因特异性引物(10nM)对各0.45μL，60ng/μL的DNA模板1μL，ddH2O 5.6μL。
6.根据权利要求1所述的一种秀珍菇同核体菌丝鉴定的InDel标记方法，其特征在于：所述步骤(4)中的PCR扩增反应选用的酶为东洋纺KODone-plus套装。
7.根据权利要求1所述的一种秀珍菇同核体菌丝鉴定的InDel标记方法，其特征在于：所述步骤(1)中的孢子收集器置于25℃培养箱中收集其孢子。
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