[发明专利]一种山羊精原干细胞体外诱导分化培养方法

说明书

本发明公开了一种山羊精原干细胞体外诱导分化培养方法。所公开的方法包括采用同时添加有RA和BMP4的细胞培养液对山羊精原干细胞进行体外诱导分化培养。本发明通过外源添加RA和BMP4构建山羊SSCs体外诱导分化体系，有效提高了SSCs分化基因Stra8、c‑KIT的表达，为SSCs应用于转基因动物制备、生殖医学和家畜资源保护等提供有效途径。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体通过外源添加RA和BMP4构建一种山羊精原干细胞体外诱导分化体系。

背景技术

精原干细胞(SSCs)在精子发生中发挥举足轻重的作用。SSCs是精子发生的基础，既确保了源源不断的产生精子，又保证了雄性动物生命过程中的生殖基础，对于繁衍后代具有非常重要的作用。SSCs的分化和自我更新能够保证SSCs数量处于动态平衡，如果在精子发生过程中出现分化受阻，将导致精原细胞的积累，从而影响精子的持续发生。SSCs的分化受到内在和外在因素的严格控调，睾丸内的细胞和细胞因子对于SSCs的分化具有重要的调控作用。

精原干细胞体外培养的建立首先是啮齿动物，为家畜SSCs体外培养体系的建立提供了基础。除目前公认的GDNF外，通过添加其他生长因子和激素也可以实现SSCs的长期培养。目前，在兔子、日本鹌鹑、树鼩中成功建立了有效的长期培养体系，但关于大家畜尤其是山羊的SSCs研究进展十分缓慢，目前还没有成功建立大家畜SSCs体外培养体系。

发明内容

针对现有技术的缺陷或不足，本发明提供了一种山羊精原干细胞体外诱导分化培养方法。

为此，本发明提供的山羊精原干细胞体外诱导分化培养方法包括：采用同时添加有RA和BMP4的细胞培养液对山羊精原干细胞进行体外诱导分化培养。

进一步，采用细胞培养液对山羊精原干细胞进行传代培养，之后采用同时添加有RA和BMP4的细胞培养液对经传达培养1～3次后的精原干细胞进行体外诱导分化培养。

进一步，本发明的方法包括：

(1)分离纯化山羊精原干细胞；

(2)采用细胞培养液对分离纯化的山羊精原干细胞进行传代培养，之后采用同时添加有RA和BMP4的细胞培养液对经传达培养1～3次后的精原干细胞进行体外诱导分化培养。

优选的，所述RA和BMP4的添加量分别为10±0.1nM和50±0.1ng/mL。

可选的，所述细胞培养液为含有FBS的DMEM培养基。

本发明通过外源添加RA和BMP4构建山羊SSCs体外诱导分化体系，有效提高了SSCs分化基因Stra8、c-KIT的表达，为SSCs应用于转基因动物制备、生殖医学和家畜资源保护等提供有效途径。

附图说明

图1为分离纯化前后的山羊精原干细胞电镜图，A为差贴前，B为差贴后；

图2为山羊精原干细胞传代培养3天后的克隆团电镜图，A为传代培养前，B为经3传代培养后；

图3为传代长期培养的山羊精原干细胞通过CD90/PLZF免疫荧光双标记染色法鉴定及双标记结果Merge融合图；

图4为实施例培养液中添加RA和BMP4培养24h后山羊精原干细胞分化相关基因表达图。

具体实施方式

除非另有说明，本文中的术语根据相关领域普通技术人员的常规认识理解。

本发明是用同时添加有RA和BMP4的基础细胞培养液对山羊精原干细胞进行体外诱导分化培养，其中基础细胞培养液为适合山羊精原干细胞体外分化生长的培养液，包括但不限于现有技术已经公开的培养液，也可以是已与培养液自身的作用改进后的细胞培养液。