[发明专利]一种pH敏感的抗氧化纳米载体及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种pH敏感的抗氧化纳米载体的其制备方法，包括以下步骤：(1)将壳聚糖溶解在蒸馏水中，得到壳聚糖溶液；(2)将N‑乙酰‑L‑组氨酸完全溶解在二甲基亚砜中，然后加入N,N'二咪唑；搅拌后将溶液蒸发干，加入壳聚糖溶液搅拌，透析后冷冻干燥得到N‑乙酰‑L‑组氨酸接枝的壳聚糖；(3)取EDC和NHS偶联剂，搅拌均匀后加入N‑乙酰半胱氨酸，得到羧基活化的N‑乙酰半胱氨酸；(4)将N‑乙酰‑L‑组氨酸接枝的壳聚糖和羧基活化的N‑乙酰半胱氨酸混合后加入到TEMED/HCI缓冲溶液中；在磁力搅拌下反应6‑10h，然后应用透析袋透析，再冷冻干燥处理得到pH敏感的抗氧化纳米载体。本发明制得的抗氧化纳米载体能促进干细胞存活，并高效的在酸性微环境中靶向传递、释放药物。

技术领域

本发明涉及技术领域，更具体地说，它涉及一种pH敏感的抗氧化纳米载体及其制备方法和应用。

背景技术

骨髓间充质干细胞在骨损伤修复中的应用具有很重要的价值。然而，外伤、手术等原因所致的骨缺损会在不同程度上，破坏骨缺损区的血液供应，致使骨缺损区处于相对缺血缺氧的状态，同时又由于局部的炎症微环境，代谢产物堆积等多种因素均会导致移植的干细胞成活率下降，严重限制了骨髓间充质干细胞在骨损伤修复中所发挥的重要作用。因此，在骨损伤修复中如何促进移植的干细胞在支架中生存，提高其抗氧化损伤、抗凋亡能力，充分发挥其成骨分化的潜能至关重要。

研究证明，当间充质干细胞移植于骨缺损处或心肌、肾脏及脑的梗死区域后，会因局部的缺血缺氧及炎症微环境而发生氧化应激，使细胞内活性氧自由基(ROS)产生增加，进而促进Bax表达上调，抑制Bcl-2的表达，引起线粒体通透性转化孔(MPTP)开放，跨膜电位降低，细胞色素C(cyto-c)以及凋亡诱导因子(AIF)释放，最终激活下游的Caspase-9及Caspase-3而诱导移植的干细胞发生凋亡。在此过程中，活性氧(ROS)作为一类具有氧化能力的离子、分子和自由基，是细胞线粒体凋亡通路中的重要中介。因此，可通过清除细胞内ROS的方式来提高移植的干细胞在缺血缺氧局部环境中的抗凋亡能力。

在近几年的研究中，一些学者通过利用白藜芦醇、绿茶提取物、香草素、褪黑素、七氟、高密度脂蛋白、番茄红素、维生素E等抗氧化剂来清除细胞内的ROS，结果均证实清除细胞内的ROS能够明显提高支架中间充质干细胞在局部缺血缺氧，炎症微环境中的抗凋亡能力。由此可见，抗氧化剂的应用在促进骨损伤修复中发挥着较大的作用。在众多抗氧化剂中，N-乙酰-L-半胱氨酸(NACC)是一种抗氧化性能较强的氨基酸，被Zafarullah M称为是细胞内ROS的清道夫，可通过其活性巯基直接清除嗜电子反应物如H₂O₂、·OH、·O²-等ROS自由基，同时NACC脱乙酰基后生成的半胱氨酸又能够促进体内抗氧化物质谷胱甘肽的合成。目前骨组织工程依然面临由于局部的缺血缺氧酸性微环境，代谢产物堆积等多种因素均会导致的移植的干细胞成活率低，从而严重影响了骨缺损修复的效能。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种pH敏感的抗氧化纳米载体的制备方法，制得的抗氧化纳米载体能促进干细胞存活，并高效的在酸性微环境中靶向传递、释放药物。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种pH敏感的抗氧化纳米载体的制备方法，包括以下步骤：

(1)将壳聚糖溶解在蒸馏水中，得到壳聚糖溶液；

(2)将N-乙酰-L-组氨酸完全溶解在二甲基亚砜中，然后加入N,N'二咪唑；搅拌后将溶液蒸发干，加入壳聚糖溶液继续搅拌，透析后冷冻干燥得到N-乙酰-L-组氨酸接枝的壳聚糖；

(3)取EDC和NHS偶联剂，搅拌均匀后，加入N-乙酰半胱氨酸，得到羧基活化的N-乙酰半胱氨酸；