[发明专利]外泌体表面展示棘突蛋白Spike的纳米抗体用于中和新冠病毒的生产方法

权利要求书

1.外泌体表面展示棘突蛋白Spike的纳米抗体，其特征在于：该外泌体的表面展示有Spike纳米抗体。

2.根据权利要求1所述的外泌体表面展示棘突蛋白Spike的纳米抗体，其特征在于：Spike纳米抗体通过喷雾方式直接通过气溶胶介导递送至气道上皮。

3.根据权利要求1所述的外泌体表面展示棘突蛋白Spike的纳米抗体，其特征在于：Spike纳米抗体在雾化、冻干和常温条件下仍保持活性。

4.根据权利要求1所述的外泌体表面展示棘突蛋白Spike的纳米抗体，其特征在于：Spike纳米抗体与新冠病毒上突刺蛋白紧密结合。

5.如根据权利要求1-4任意一项所述的外泌体表面展示棘突蛋白Spike的纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下制作步骤：

步骤一：Expi293F^TM细胞利用SMM 293TII培养基培养至4×106活细胞/mL；

步骤二：准备1000ml细胞量，需要准备pdisplay-spike-nanobody 500μg质粒，用10mLOpti-MEM培养基稀释质粒，混匀后静置5分钟；

步骤三：准备1000μL PEI试剂，用10mL Opti-MEM培养基稀释，混匀后静置5分钟；

步骤四：将步骤二、步骤三中稀释后的质粒及转染试剂混匀静置30分钟；

步骤五：将试剂加入细胞中，混匀，放置于培养箱内进行培养；

步骤六：转染8小时后，离心(800rpm,10min),去掉上清，细胞沉淀转移到新的摇瓶中，重新加入1000ml SMM 293TII培养基；

步骤七：培养72h后，离心(800rpm,10min)，收集第一次的上清；

步骤八：离心后的细胞沉淀继续加培养基1000ml,再培养72h后，离心(800rpm,10min)，收集第二次的上清；

步骤九：二次上清合并一起进行差速离心富集法，具体为：

1)、离心去细胞及碎片：将上清至离心管中，于4℃以3000g离心10min，去除细胞碎片；离心后上清液转移到新的离心管中；

2)、离心去杂质：转移后的上清液于4℃以10000g离心30min，去除样品中杂质，将离心后的上清液转移至新的离心管中；

3)、离心收集外泌体：转移后的上清液于4℃以200000g离心60min，将离心后的沉淀用PBS溶解制作出外泌体纳米抗体。

6.根据权利要求5所述的外泌体表面展示棘突蛋白Spike的纳米抗体的制备方法，其特征在于：步骤一中的培养条件是用培养悬浮细胞的一次性无菌通气摇瓶，轨道摇床置于≥80％相对湿度和8％CO2的37℃培养箱。