[发明专利]一种抗禽流行性感冒病毒转移因子的制备方法

说明书

本发明涉及一种体外制备抗禽流行性感冒病毒特异性转移因子的制备方法。本发明以鸡脾脏或外周血为原料，制成淋巴细胞单层，然后用植物血凝素和禽流行性感冒病毒诱导培养淋巴细胞，体外生产抗禽流行性感冒病毒特异性转移因子。本发明所制备的特异性转移因子可以用于预防和治疗禽流行性感冒，同时可以提高鸡自身的免疫力。本发明具有特异性强、成本低、效果好等优点，是一种较为理想的抗禽流行性感冒病毒转移因子制备方法。

技术领域

本发明涉及兽药领域，更具体的说，是一种抗禽流行性感冒病毒转移因子的制备方法。

背景技术

它是由甲型流感病毒的一种亚型（也称禽流感病毒）引起的一种急性传染病，也能感染人类，被国际兽疫局定为甲类传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。人感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高，通常人感染禽流感死亡率约为33%。此病可通过消化道、呼吸道、皮肤损伤和眼结膜等多种途径传播，区域间的人员和车辆往来是传播本病的重要途径。近年来还出现新亚型流感病毒H₇N₉，目前国内外都没有针对H7N9禽流感病毒的疫苗，给社会公共安全造成极大的危害。因此，寻找一种治疗禽流感的特效药成为近年来的研究热点。转移因子(Transfer factor, TF)是T淋巴细胞释放的一种能够转移致敏信息的可透析小分子物质-多肽核苷酸复合物，它能够特异地将供体的细胞免疫信息转移给受体正常的淋巴细胞，从而增强受体的免疫功能。可以抵抗真菌、病毒等非细菌性感染，也可以是否白介素与干扰素作用于免疫应答过程。TF含多种成分，分子量小，无热原，无抗原性，无毒副作用，是一种新型而又安全的免疫制剂。此外，转移因子无种属特异性，动物来源的转移因子可用于人体。

目前转移因子的生产工艺主要是通过研磨动物脏器等，反复冻融并经半透膜透析得到，工艺复杂，无特异性，回收率低。本发明通过体外制备抗禽流行性感冒病毒特异性转移因子特异性强、产出率高，对转移因子的大规模工厂化生产以及大范围应用具有很好的促进作用。近年来，不断有研究发现转移因子可提高机体抵抗力或调节免疫力预防多种疾病，可用于禽流行性感冒的预防和治疗。

发明内容

本发明的目的是克服现有转移因子技术中制备以及针对疾病没有特异性，治疗效果不稳定等缺点，提供一种体外免疫方法生产特异性强、成本低、产出率高、效果更好的抗禽流行性感冒病毒特异性转移因子的制备方法。

本发明体外制备抗禽流行性感冒病毒特异性转移因子的制备方法，按照以下步骤进行：

（1）无菌环境下采取鸡脾脏，用外周血制备淋巴细胞单层。无菌静脉采取动物全血10-30ml，加0.8%肝素溶液0.2m1抗凝，静置30-60min，用带胶球吸管吸取红细胞层以上的所有血浆，特别是紧接红细胞层上的白细胞层要尽量吸取，分装于消毒离心管内，用PBS (pH为7.2)液反复洗涤2-3次，离心速度1000-1800转/分，然后用含30%犊牛血清水解乳蛋白40ml进行白细胞培养，混合均匀后分装于容量100ml细胞培养瓶中，塞紧瓶塞，置37℃细胞培养箱中，经2-3天，白细胞均匀贴壁，即制成淋巴细胞单层；

（2）对所制备的淋巴细胞单层进行传代培养。显微镜下观察（1）中所制备的淋巴细胞单层，确认其生长状态良好即可进行细胞的传代培养；

（3）病毒的提纯：将禽流行性感冒病毒接种于7-9日龄的鸡胚尿囊腔内，37℃培养24-120h增值病毒，将收集的尿囊液反复冻融三次后，超声破碎处理，离心，取沉淀，根据病毒粒子的大小利用密度梯度高速离心，离心速度10000-12000转/分，得到较为纯正的病毒；

（4）抗禽流行性感冒病毒特异性转移因子的制备。当传代的淋巴细胞长成单层后，用植物血凝素（终浓度为100mg/L）和禽流行性感冒病毒（终浓度为800-1200血凝单位/ml）诱导培养，离心培养2-3天后，10000转/分、20-30min离心细胞培养液，取上清液，将其置于4℃下磁力搅拌透析24-36h，超滤除菌，即获得体外制备抗禽流行性感冒病毒特异性转移因子。