[发明专利]快速简易提取厌氧真菌DNA的方法及应用

权利要求书

1.快速简易提取厌氧真菌DNA的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

(1)菌株培养：将厌氧真菌接种在厌氧培养基里，加入复合抗生素，静置培养；

(2)收集菌体：将步骤(1)得到的菌液离心，取菌丝体；

(3)破壁：将步骤(2)得到的菌丝体被快速液氮研磨后取0.1-1g加入到离心管中，再加入钢珠，冷却，振荡离心管，振荡期间离心管保持冷冻状态，使厌氧真菌细胞壁破碎；

(4)抽提DNA：向步骤(3)得到的溶液中加入抽提缓冲液，振荡，恒温水浴后，加入乙酸铵，混匀，冷却，离心，取上清液，弃沉淀物和钢珠；上清液用等体积的Tris饱和酚：氯仿：异戊醇溶液抽提2次，混匀，离心，去除杂蛋白；

(5)沉淀DNA：取步骤(4)得到的上层水相至另一离心管中，加入异丙醇，混匀，低温放置以沉淀DNA；离心，弃上清，用乙醇洗涤沉淀，用无菌双蒸水溶解沉淀，即得厌氧真菌DNA。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的厌氧培养基的配制步骤如下：酵母膏1.0g，蛋白胨1.0g，葡萄糖1.0g，NaHCO₃ 7.0g，刃天青1.0g/L 1mL，L-半胱氨酸盐酸盐1.7g，晨饲前采集瘤胃液8000×g，4℃离心20min后的上清170mL，盐溶液I 165mL，盐溶液II 165mL，蒸馏水定容至1000mL；盐溶液I的配制步骤如下：NaCl 6g，(NH₄)₂SO₄ 3g，KH₂PO₄3g，CaCl₂·2H₂O 0.4g，MgSO₄·2H₂O 0.6g，蒸馏水定容至1000mL；盐溶液II配制步骤如下：K₂HPO₄ 4g，蒸馏水定容至1000mL。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)厌氧真菌的接种量为10％v/v，复合抗生素的接种量为1％v/v，所述的复合抗生素具体为复合抗生素为青霉素钠和硫酸链霉素，终浓度分别为1600IU/mL和2000IU/m L。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的菌液离心的转速为5000g/min，离心时间为5min。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的冷却是液氮快速研磨菌丝体后将0.1g被研磨的菌丝体置于离心管中，再加入钢珠2颗，将离心管放在液氮中冷却，振荡离心管，振荡过程中离心管保持冷冻状态，振荡时间为3-5min。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的抽提缓冲液的配制步骤如下：Tris2.4228g，NaCl 1.461g，乙二胺四乙酸二钠0.9306g，十二烷基硫酸钠2g，蒸馏水定容100mL，并用HCl调pH值至8.5。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的乙酸铵加入量为浓度10M 200μL，Tris饱和酚：氯仿：异戊醇溶液的加入量是与上清液等体积。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述的异丙醇加入量为上层水相的0.5-0.6倍体积，且所述的异丙醇于-20℃预冷。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述的无菌双蒸水的加入量为50μL。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述的乙醇加入量为1mL 75％。