[发明专利]人类白细胞抗原一步测序分型方法及其应用

说明书

本发明提供了一种针对HLA的模棱两可分型引物组，以及包含其的HLA测序分型的特异性引物组合物，以及相应的HLA基因分型方法。本发明通过增加模棱两可分型引物组，将普通HLA测序分型方法因模棱两可型别需要复查的比例从10‑15％有效的控制到了0.1％以下，节省了宝贵的医疗时间、人力成本和试剂成本。

技术领域

本发明具体涉及人类白细胞抗原一步测序分型方法及其应用。

背景技术

人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen,HLA)的编码基因位于第6号染色体短臂上，是构成移植排斥反应的重要抗原物质，在进行骨髓和器官移植时，供受者之间HLA相容程度越高，排斥反应的发生率越低，移植成功率和移植器官长期存活率越高；反之，则容易发生排斥反应。器官移植成功与否的关键在于控制移植物排斥反应，目前主要通过移植前检测供者和受者的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQB1、HLA-DRB1位点匹配情况预测可能的移植排斥反应。随着生命科学的发展，HLA基因在疾病辅助诊断，临床用药，免疫治疗和法医鉴定等领域显示了越来越重要的价值。过去HLA分型鉴定都是以血清学的方式进行，但该方法影响因素较多，会导致假阴性和假阳性结果，使准确性较低，而且获得的是低分结果。为了保证HLA分型结果的准确性和扩展临床应用，能够进行高分辨率分型的HLA核酸分型检测试剂盒(PCR-SBT)应运而生。设计与HLA基因相结合的特异性扩增引物，当引物序列与待测目标序列能完全匹配时，进行聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)。利用琼脂糖凝胶电泳法对PCR反应结果进行检测分析，以确定目的基因是否扩增。经电泳初步鉴定的反应扩增物会被纯化进行下一步的测序分析，再利用分型软件对人类白细胞抗原进行分型鉴定。测序引物设计区域位于HLA各位点外显子表达区域的上下游，以充分鉴定各个等位基因的序列。虽然测序方法能够准确的给出高分辨率的分型结果，但由于模棱两可型别的存在，第一次测序分型的成功率在85％左右，15％的样本需要再次进行模棱两可型别的区分，导致实验时间延长了将近一倍，不利于结果的按时报告，同时也增加了人力和试剂成本。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种简便快捷检测HLA基因分型的方法，并且将人群复核比例控制在0.1％以下，以解决现有技术对模棱两可型别复查比例居高不下的问题。

本发明所述的模棱两可型别见表7中的高频模棱两可型别。

本发明提供针对HLA的模棱两可分型引物组，所述模棱两可分型引物组由序列66-序列78的单链DNA组成。

本发明还提供HLA测序分型的特异性引物组合，由上述针对HLA的模棱两可分型引物组、测序引物组、扩增引物组组成；所述扩增引物组由序列表序列1-序列39的单链DNA组成；所述测序引物组由序列表序列40-序列65的单链DNA组成。

本发明所提供的一种HLA测序分型系统，由X1和X2组成；所述X1为所述HLA测序分型的特异性引物组合物，所述X2为X2.1和/或X2.2:

X2.1、进行PCR扩增所需的试剂和/或仪器；

X2.2、进行PCR测序所需的试剂和/或仪器。

上述系统中，所述进行PCR扩增所需的试剂可含有dATP、dTTP、dCTP和dGTP的dNTPs、transfastpfu酶和/或PCR反应缓冲液，也可仅为所述dNTP混合物、所述transfastpfu酶和/或所述PCR反应缓冲液；所述进行PCR扩增所需的仪器可为PCR仪。

上述系统中，所述进行PCR测序所需的试剂可含有BigDye测序试剂和/或酶解纯化产物；所述进行测序所需的仪器可为测序仪。

上述系统中，所述HLA测序分型的特异性引物组合和所述进行PCR扩增所需的试剂、所述进行PCR测序所需的试剂均可独立包装。所述HLA测序分型的特异性引物组合中的各条单链DNA均独立包装。进行PCR扩增所需的各试剂均可独立包装。