[发明专利]一种人脐带间充质干细胞的分离培养方法

说明书

本发明公开了一种人脐带间充质干细胞分离培养方法，包括采集储运脐带，华通氏胶组织分离，细胞提取及培养，细胞传代及保种冻存；本发明采用的分离方法为将脐带外膜与血管剔除，得到纯净的华通氏胶组织，保证分离的间充质干细胞纯度更高、数量更多；本申请利用二步酶消化法大大缩短了原代细胞的制备周期，且细胞活性好，增殖能力强，具有良好的分化潜能，分离效率高，尤其可满足大规模实验研究及临床应用的细胞需求。

技术领域

本发明属于干细胞与再生医学领域，涉及干细胞的分离与培养技术，具体涉及一种从人脐带中分离提取培养间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞是一类特殊干细胞，具备强大的自我更新和多向分化潜能。间充质干细胞因其在免疫调节与组织修复方面的巨大潜能已获得医学各领域的高度关注。间充质干细胞取材来源甚广，可从骨髓、滑膜、脂肪、脐血、脐带等组织中分离获得。此外，经特殊诱导可以向骨细胞、内皮细胞、软骨细胞、心肌细胞、脂肪细胞等多种组织细胞分化。目前间充质干细胞的主要研究来源是骨髓，而一方面骨髓获取难度大，另一方面从骨髓中制备的间充质干细胞增殖分化活性受年龄增长的影响，且存在病毒易感性，故寻找间充质干细胞骨髓替代来源的需求日益迫切。

研究表明，从人脐带华通氏胶组织中可提取获得大量高纯度的间充质干细胞。脐带具有来源丰富，取材方便、不受限，不存在伦理争议等优势，为间充质干细胞的获取提供了新的来源途径。与骨髓源性间充质干细胞一样，脐带来源细胞同样具有低免疫原性、调节免疫炎症、促进组织损伤修复等的功能特点，有望作为一项有效的治疗策略广泛应用于临床。

但如何从脐带华通氏胶组织当中高效分离获得较为纯净的间充质干细胞仍是阻滞当前研究进展的主要问题。目前，从脐带华通氏胶组织中提取间充质干细胞的主流方法包括蛋白酶消化法与组织块贴壁法。传统的蛋白酶消化法主要通过应用胶原酶、透明质酸酶及中性蛋白酶联合作用以获取细胞，消化时间达6小时及以上，不仅延长了细胞体外分离时间，且易导致细胞活性受影响(BeeravoluN, et al.Isolation and Characterizationof Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta.JVis Exp.2017；(122):55224；Zhang Z,et al. Human Umbilical Cord Mesenchymal StemCells Inhibit T Follicular Helper Cell Expansion Through the Activation ofiNOS in Lupus-Prone B6.MRL-Faslpr Mice. Cell Transplant.2017；26(6):1031-1042.)。组织块贴壁法虽然具有工艺简单、成本低的优势，但其细胞获取周期长，且细胞获得率低，难以满足大规模实验研究及临床应用的需求，严重影响实验进展。

发明内容

本发明针对上述不足，提供一种更为高效的脐带间充质干细胞分离培养方法，该简化了操作工艺，缩短了酶作用时间，无需特殊消化工具，可大大缩短原代细胞的分离周期，快速获得大量高纯度且活性高的间充质干细胞。

本发明是通过以下步骤实现的：

一种从脐带华通氏胶组织中提取培养间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

(1)采集储运脐带：无菌条件下获取脐带，初步清理脐带内动静脉血后橡皮筋结扎脐带两端，浸泡于无菌生理盐水中，低温(0-4℃)保存转运，6h内进行处理；

(2)华通氏胶组织分离：用无菌生理盐水反复冲洗，去除脐带表面及血管内残存血液，然后用无菌剪刀将脐带分为3-4cm左右小段，再将小段脐带放在生理盐水浸湿的无菌纱布上，用眼科剪自浅层纵向剪开脐带外膜组织，固定一侧外膜，手术刀刮取剥离华通氏胶与外膜，后用止血钳剔除血管，过程中保证组织湿润；最后用无菌生理盐水冲洗分离后的华通氏胶组织再剪碎成1-3mm³组织块；

(3)细胞提取及培养：