[发明专利]一种植物原生质体单细胞悬液的制备方法及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种植物原生质体单细胞悬液的制备方法及其应用。本发明提供的制备方法，通过将植物原生质体处理、孵育、酶解、过滤、离心、活性检测等过程，最终制成单细胞悬液。采用本发明所述方法制成的植物原生质体单细胞悬液，细胞活性高达95％以上，可满足各类高通量单细胞测序平台的细胞悬液质量要求，应用价值高。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种植物原生质体单细胞悬液的制备方法及其应用。

背景技术

多细胞生物个体由多种形态功能不同的细胞组成，细胞的异质性这个普遍存在的生物学现象亟待我们展开深入研究。近十年来，单细胞测序技术发展迅猛，具备高通量、低价格和单分子分辨率和高稳定性等多重技术光环的10×genomics单细胞技术的涌现，使万级别的单细胞研究成为成本可接受的事情。单细胞测序技术已在肿瘤、免疫、发育等方向获得了良好的应用，但植物单细胞研究仍处于早期发展期，目前的所有研究对象都集中在拟南芥根和玉米花粉，研究对象极度匮乏。与动物细胞相比，植物细胞受到一层细胞壁的保护，给植物单细胞悬液的制备造成了更大的障碍。植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，只有有效去除细胞壁中的纤维素和果胶，我们才可能获得高质量的植物单细胞悬液，从而突破植物单细胞测序技术障碍。

植物原生质体分离的方法主要有机械法和酶解法两种。机械法分离原生质体过程复杂且得率较低；酶解法可以快速批量获取原生质体且对细胞损伤小，是目前使用较为广泛的分离方法。该方法多通过同时添加果胶酶和纤维素酶来酶解细胞，以去掉细胞壁，但是，在实际应用过程中，植物组织伴随着发育程度不同和功能不同，具有不同的细胞壁厚度和液泡渗透压，如果仅含这两种酶很容易使得最终制成的单细胞悬液的细胞活性低，且还易被杂菌污染，影响细胞的活性。

基于此，中国专利申请CN111647549A公开了一种同时适用于动物、植物单细胞的分离方法，该方法虽然具有适用范围广、细胞活性高等优点，但是其在制备过程中使用的硝酸镧属于化学危险品，对人体有害且具有助燃性，此外，采用的玻璃珠在实验过程中损耗较大，大大增加了试验成本。

综上可知，开发一种成熟通用的，适用于植物原生质体单细胞悬液的制备方法是一件迫在眉睫的事情。

发明内容

针对现有技术普遍存在的缺陷，本发明创造性的提供了一种植物原生质体单细胞悬液的制备方法及其应用。采用本发明所述方法制成的原生质体单细胞悬液，细胞活性高达95％以上，可用于单细胞转录组测序文库的构建，应用价值高。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种原生质体单细胞悬液的制备方法，包括如下步骤：

S1、取45～55mg的植物组织切成1mm³的薄片，置于10mL的离心管中，向其中加入5mL的清洗液，摇晃混匀，静置10～15s，除去上清液，制得组织薄片；

S2、向步骤S1制得的组织薄片中加入5mL的酶消化液，于30℃下避光孵育0.5～1h，镜检至消化完全，制得酶解消化液；

S3、将步骤S2制得的酶解消化液用1mL的宽口枪头转移，通过细胞筛，并向其中加入4mL清洗液，混匀，经离心处理，去掉上清液，用宽口枪头加入2mL清洗液重悬原生质体并离心，连续处理2次，去掉上清液，制得细胞沉淀；

S4、将步骤S3制得的细胞沉淀经除菌混合液清洗2～3次，离心去除上清液，将细胞沉淀用清洗液溶解，并用显微镜细胞计数板和台盼蓝染色检测细胞浓度、活性，即可。

优选地，步骤S1、S3及S4所述的清洗液为含质量百分数为0.04％的BSA的甘露醇0.4M。

优选地，步骤S2所述的酶消化液为由0.5M甘露醇、质量分数为15％的纤维素酶、质量分数为1％的果胶酶及质量分数为3％的离析酶组成。