[发明专利]一种定量测定血浆中PEGylated-IL-2(1A)的方法及应用

说明书

本发明涉及一种定量测定血浆中PEGylated‑IL‑2(1A)的方法及应用，属于化学分析技术领域。本发明的方法包括标准品在血浆中配制、离心后取上清并且加入0.1%BAS后抽真空浓缩，再复溶后进行液相馏分收集RP‑HPLC实验操作。在紫外检测器出口处，分别收集样品。收集后的样品在37℃条件进行酶切3小时，然后加入0.1%甲酸终止反应进行LC‑MS/MS样品分析。该方法实现了高效、快速、准确、灵敏的使用LC‑MS‑MS定量测定体内PEGylated‑IL‑2(1A)。

技术领域

本发明涉及一种定量测定血浆中PEGylated-IL-2(1A)的方法及应用，属于化学分析技术领域。

背景技术

IL-2(Interleukin-2 )是一种白介素，是免疫系统中的一类细胞生长因子，能调控免疫系统中白血球的细胞活性，促进Th0和CTL的增殖，也参与抗体反应、造血和肿瘤监视。在临床上主要用于肾癌、恶性黑色素瘤、结肠癌等。也可以与LAK、手术、放疗、化疗相结合用于小脑星形细胞瘤、舌癌、喉癌、鼻咽癌、肝癌、肺癌和胃癌手术转移的患者，以及癌性胸腹水等等。IL-2(1A)的检测和控制关系到药品的安全性和实效性，IL-2(1A)的不良反应与血浆分布时相半衰期为6～13分钟,β清除时相半衰期为30～120分钟。所以通过PEGylated对IL-2修饰来延长体内循环时间，降低免疫原性，提高稳定性，从而达到更好的效果，减少不良反应。目前，建立高效、快速、准确、灵敏的PEGylated-IL2浓度检测方法十分必要。

目前没有关于PEGylated-IL-2在血浆中检测方法的(LC-MS/MS)报道，使用LBA(ligand binding assay) 或者ELISA(酶联免疫吸附)测定PEG化生物药PK或者TK样品是常用方法，但是，用LC/MS/MS 测定PEG化生物药PK或者TK样品越来越广泛被应用到生物药研发中去。主要原因是LBA或者ELISA，这二种方法前者需要特殊试剂，有内源性干扰物质，后者方法建立时间长，受内源性抗体的干扰，非特异性结合与交叉免疫等等。而LC-MS/MS质谱与液相方法的建立、样品前处理与方法学论证，耗时较短。另外，使用同位素标记的肽段或者蛋白质作为内标，可以有效校正分析过程中的偏差和基质效应。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷，提出一种定量测定血浆中PEGylated-IL-2(1A)的方法及应用，填补空白。

本发明通过以下技术方案解决技术问题： 本发明首先提出一种定量测定血浆中PEGylated-IL-2(1A)的方法，其特点是使用LC-MS-MS定量测定PEGylated-IL-2(1A)。

该方法中需先将血浆中PEGylated-IL-2(1A)样品经过样品前处理，再使用LC-MS-MS定量测定PEGylated-IL-2(1A)。其中，所述样品前处理包括蛋白沉淀、RP-HPLC收集样品、真空浓缩后酶切，使用LC-MS-MS定量测定PEGylated-IL-2(1A)。所述蛋白沉淀步骤中加入甲酸水与异丙醇进行酸沉淀。

进一步地，上述方法中所述样品前处理，包含如下步骤，

第一步、样品蛋白沉淀，将已知浓度的样品/标准品加入甲酸水与异丙醇进行酸沉淀；

第二步、将浓缩至干的样品放置平衡至室温，将经过蛋白沉淀的样品/标准品浓缩、干燥制得样品/标准品的粗品；

第三步、 RP-HPLC进行样品收集，将样品/标准品的粗品加入100 μL 0.1%FA水溶液复溶、离心、取上清进行RP-HPLC检测收集；

第四步、酶切，将第三步收集的各样品，各取400 μL至0.5 mL螺口管中，每支样品管中加入1%BSA溶液3 μL，混合均匀后，瞬离，45℃，真空浓缩至干，加入酶，进行酶切作用。