[发明专利]Taq DNA聚合酶突变体、PCR反应试剂和试剂盒

说明书

本发明公开了一种Taq DNA聚合酶突变体、PCR反应试剂和试剂盒，涉及基因检测技术领域。本发明公开的Taq DNA聚合酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示。采用该Taq DNA聚合酶突变体进行PCR反应可直接以血液样本作为模板进行检测，具有检测时间短、灵敏度高、特异性强以及准确率高等特点。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体而言，涉及Taq DNA聚合酶突变体、PCR反应试剂和试剂盒。

背景技术

目前不孕不育症困扰着全球约10％-15％的育龄夫妇，其中男性因素约占50％(Bushnik T et al.,Hum Reprod,2012,27:738-746)。引起男性不育的因素众多，除了内分泌激素紊乱、生殖道炎症、精索静脉曲张、免疫异常和理化等因素外，约30％以上由遗传缺陷导致的精子发育障碍而引起(Bhasin S et al.,J Clin Endocrinol Metab,1994,79:1525-1529；Chang P L et al.,Human Reprod,1999,14:2689-2694)，而Y染色体微缺失是主要的遗传学因素之一(Luddi A et al.,N Engl J Med,2009,360:881-885)。

因此，对Y染色体AZF微缺失进行检测具有重要的临床意义：①可为临床上一些病因不明的男性不育患者找出病因；②可为男性不育患者的临床诊疗提供依据和指导。

目前，对Y染色体微缺失检测的方法主要包括原位杂交法、基因测序法、PCR凝胶电泳法和实时荧光PCR法。实时荧光PCR法具有操作简便、灵敏度高和自动化程度高，不需要电泳检测和杂交等步骤等优点，是一种高效简单的检测方法。但是，实时荧光PCR法对PCR反应体系要求较高，并且当该方法用于同时检测多位点时，不仅对引物和探针的设计要求较高，而且对Taq DNA聚合酶的特异性、扩增能力和稳定性要求较高，具体而言，传统野生型TaqDNA聚合酶在75-80℃时活性最高，但是在温度较低时，该聚合酶的活性依然存在。这就使得在PCR反应的初始阶段，由于引物的量比模板的量高出很多，在仪器升温过程中，很容易出现引物互搭或引物与模板中的一些非靶点错配的现象，在DNA聚合酶的作用下进行延伸，形成引物二聚体和非特异性产物。这些引物二聚体和非特异性产物又可以作为引物或模板在以后的PCR循环中继续扩增，使非特异产物不断扩增和累积，如果PCR的循环数较多、扩增子的GC含量较高以及多重PCR体系，也很容易产生引物二聚体和非特异性产物，既降低了目的产物的扩增效率，又影响PCR在检测等方面的应用。

针对上述问题，中国专利CN201711391569.5公开了一种用于检测Y染色体微缺失的核酸组合及试剂盒和应用，所述核酸组合及试剂盒在用于Taqman探针多重荧光PCR检测Y染色体微缺失时具有灵敏度高和特异性强的优点。但进一步研究发现上述核酸组合及试剂盒还可从以下方面进行进一步优化：(1)检测样本为EDTA抗凝全血提取的人类DNA样本，检测前需商业化的试剂盒提取人类基因组DNA，不仅增加了试剂成本及时间成本，而且提取过程中存在因操作不当引起交叉污染或样本混淆的风险，因此有必要进一步优化PCR反应液，以达到无需提取基因组DNA、可直接以血液样本为模板实现Y染色体微缺失准确检测的目的；(2)其Taqman探针多重荧光PCR反应体系中的DNA聚合酶为常规改造的DNA聚合酶，在Taqman探针法荧光PCR反应中，Taq DNA聚合酶需同时具有很好的聚合酶活性和5’-3’外切酶活性，以保证扩增效率以及荧光信号释放的效率，而常规Taq DNA聚合酶改造和修饰方案因专注于提高聚合酶性能而忽视了对外切酶性能的考察，从而抑制其外切酶活性，不利于进行Taqman探针法荧光PCR检测，因此，有必要进一步优化和改造DNA聚合酶，以达到更好的检测效果。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种Taq DNA聚合酶突变体、PCR反应试剂和试剂盒，采用该Taq DNA聚合酶突变体进行PCR反应可直接以血液样本作为模板进行检测，具有检测时间短、灵敏度高、特异性强以及准确率高等特点。