[发明专利]一种检测布鲁氏菌阿米卡星耐药性RT-PCR试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种检测布鲁氏菌阿米卡星耐药性RT-PCR试剂盒，其特征在于，该PCR试剂盒由A液、B液、阳性质控标准品和阴性质控标准品组成；所述A液包括RT-PCR缓冲液、各浓度2.5 mM的dNTP液、5 mM 的Mg²⁺溶液、2.5 U/μl 的RT-DNA聚合酶和灭菌双蒸水，每750 μL的A液对应包括RT-PCR缓冲液75 μL、dNTP液75 μL、Mg²⁺溶液75 μL、RT-DNA聚合酶25 μL、灭菌双蒸水500μL；所述B液包括用于检测布鲁氏菌的特异性引物对seq ID No.1和seq ID No.2以及探针seq ID No.3，以及检测布鲁氏菌阿米卡星耐药性的特异性引物对seq ID No.4和seq IDNo.5以及探针seq ID No.6，B液中各引物及各探针浓度均为0.2 μM，溶剂为水，各引物及各探针分别为：

seq ID No.1：5’- AATGCGATCAAGTCGGGCG -3’

seq ID No.2：5’- TGCCATCATAAAGGCCGGTG -3’

seq ID No.3：5’FAM- TGCCATCATAAAGGCCGGTG -3’BHQ-1

seq ID No.4：5’- AACTGTTCGCCAGGCTCAAG -3’

seq ID No.5：5’- AAGCGGCCATTTTCCACCAT -3’

seq ID No.6：5’VIC- TCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTT -3’BHQ-2

所述阳性质控标准品由耐药菌株调整比浊度，其菌含量约为1.5×10⁵ CFU/mL，经80℃热灭活60 min；

所述阴性质控标准品由灭菌双蒸水。

2.权利要求1所述的一种检测布鲁氏菌阿米卡星耐药性RT-PCR试剂盒的非疾病诊断治疗目的的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取待测样本的基因组DNA，经核酸浓度检测仪Nanodrop检测浓度高于1ng/μL；（2）以提取的样本基因组DNA为模板，将A液和B液按比例混合，再加入模板，同时进行阳性质控标准品、阴性质控标准品对照，进行荧光定量检测；荧光定量检测仪以LightCycler 480仪器为例；至少三个测试样品：一个A液+B液+待测试提取的DNA模板，一个A液+B液+阳性质控标准品，一个A液+B液+阴性质控标准品；

上述三个测试样品的PCR扩增体系为25μL/样品，具体包括：15 μL A液，7 μL B液，3 μL待测试提取的DNA模板或阳性质控标准品或阴性质控标准品；

两步法进行RT-PCR，荧光定量扩增程序为：95℃ 30 s，95℃ 5 s、60℃ 30 s，40个循环；

（3）结果判定：其中步骤（2）阳性质控标准品对应的样品的FAM和VIC信号均存在扩增曲线，CT值在32-35之间，步骤（2）阴性质控标准品对应的样品的FAM和VIC信号不存在扩增曲线，则试验成功；否则试验失败，需重做；

（4）步骤（3）试验成功后，对应的待测试提取的DNA模板的样品的FAM和VIC信号：待测试提取的DNA模板的FAM信号存在扩增曲线，而VIC信号不存在扩增曲线，则待测样品为布鲁氏菌但不存在阿米卡星耐药性；FAM信号存在扩增曲线，且VIC信号存在扩增曲线，则待测样品为布鲁氏菌且存在阿米卡星耐药性；FAM信号不存在扩增曲线，且VIC信号不存在扩增曲线，则待测样品为非布鲁氏菌且无阿米卡星耐药性。

3.按照权利可要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述待测样本选自血液、血清、奶样、组织样本、气溶胶样本任意一种。

4.按照权利可要求2所述的方法，其特征在于，最低检测菌含量为10² CFU/μL。