[发明专利]一种以酸枣愈伤组织为受体的遗传转化方法

说明书

本发明公开了一种以酸枣愈伤组织为受体的遗传转化方法，包括遗传转化受体的获取，农杆菌培养与浸染液制备，愈伤浸染，共培养，除菌，抑菌培养，筛选培养，抗性愈伤的鉴定。本发明利用酸枣茎段、叶片、子叶、胚轴诱导的愈伤为受体，建立酸枣遗传转化的方法。愈伤来源广泛，转化效率高，可重复性高，操作步骤简单；借助荧光标记方法辅助筛选，方便快捷；该体系为枣基因功能解析提供了便利，同时也为枣的遗传改良提供了可能。

技术领域

本发明涉及一种植物细胞工程和分子生物学技术领域，尤其涉及的是一种以酸枣愈伤组织为受体的遗传转化方法。

背景技术

枣(ZizipHus jujuba Mill.)为鼠李科(Rhamnaceae)枣属(Zizyhpus.)多年生木本作物，是我国特有的果树。枣品种繁多，枣果营养价值丰富，且具有抗氧化，抑菌消炎安神助眠，滋阴补血等功效，在食品和医药方面有着广泛的应用价值。酸枣(ZizipHus jujubaMill.var.Spinosa)，作为枣的野生种，在我国分布广泛。

随着果树功能基因组学的发展，科研工作者希望能对枣树遗传背景和基因功能信息有进一步的了解，以便更好对枣树品种进行改良。但枣花小，人工去雄困难，坐果率低，胚败育现象严重等使得枣树杂交育种困难，长期进行无性繁殖，导致人们至今对枣树遗传背景和基因功能信息仍知之甚少。枣树全基因组测序已经完成，急需来源广泛的遗传转化受体以及高效的遗传转化体系以解析枣基因组信息和进行基因功能的鉴定。酸枣作为枣的野生种，来源广泛，其愈伤组织为脱分化状态的组织，是良好的遗传转化受体，是解析枣基因组信息和进行功能基因组学研究的优选材料。

有关枣遗传转化，前人虽在不同品种上进行了一些探索，但都集中于转化再生体系的建立，致力于获得遗传转化植株，导致遗传转化受体来源有限，转化效率偏低，这不能满足枣遗传背景和基因功能解析对大量遗传转化受体和高遗传转化效率的需要。Gu,X.F借助农杆菌介导法，以冬枣茎尖为外植体获得了转基因株系(Gu,X.F.,Meng,H.,Qi,G.,Zhang,J.R.(2008).Agrobacterium-mediated transformation of the winter jujube(ZizypHus jujuba Mill.).Plant Cell,Tissue and Organ Culture,94(1),23–32.)。郝征(郝征.农杆菌介导的枣树遗传转化研究[D].河北农业大学,2012.)和罗在柒(罗在柒,郭辉力,杨亚东,杨明峰,马兰青,王有年.农杆菌介导虎杖芪合酶基因遗传转化壶瓶枣的研究[J].林业科学,2015,51(10):101-109.)等利用枣叶片为外植体分别获得了枣树抗虫和抗病的转基因株系。魏薇以木枣叶片为外植体，获得了PCR检测为阳性的小麦磷转运蛋白基因的转基因株系(魏薇.枣外源小麦磷转运蛋白基因(TaPT2)遗传转化研究[D].河北农业大学,2013.)。葛宏获得了PCR检测阳性的ZjTCP6和ZjTCP16转基因株系(葛宏.枣种质资源收集保存与ZjTCP6、ZjTCP16基因的遗传转化[D].河南农业大学,2019.)。

上述遗传转化致力于实现枣树某一品种的遗传定向改良，因而遗传转化效率低，这显然不适合基因功能解析对大量遗传转化受体及高遗传转化效率的需要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于：如何实现量产化的枣遗传转化，提供了一种以酸枣愈伤组织为受体的遗传转化及可视化快速鉴定方法。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的，本发明包括以下步骤：

(1)遗传转化受体的获取

播种酸枣无菌种子，待无菌苗长出真叶，选取酸枣茎段、叶片、子叶和胚轴，分别切成0.5～1cm和0.5～1cm×0.5～1cm大小的外植体，置于半固体MS愈伤诱导培养基，诱导酸枣愈伤，作为遗传转化材料；

(2)农杆菌培养与浸染液制备