[发明专利]一种高效筛选细菌感染特效药的细胞膜色谱柱制备方法

权利要求书

1.一种高效筛选细菌感染特效药的细胞膜色谱柱制备方法，其特征在于包括制备全细胞蛋白提取液、制备APTES共价修饰后的硅胶、细胞膜和硅胶键合及湿法装柱四个步骤；所述全细胞蛋白提取液制备中，采用变性裂解液以及非变性裂解液作为试剂，采用离心机、1.5ml离心试管和中部具有一道隔膜的50ml柱形聚乙烯离心试管作用提取工具，经以下几个步骤制得，第一步：把细胞放于1.5ml离心试管中，并加入1ml的PBS细胞洗涤溶液，然后用离心机离心3分钟，弃除上清，离心、弃除上清流程共重复三次，第二步，根据细胞沉淀体积加入预冷的PBS细胞洗涤溶液，进行细胞重悬，第三步，根据离心试管内细胞量加入变性裂解液，震荡15s，第四步，将震荡后裂解液转移于50ml柱形聚乙烯离心试管内，离心机离心30s后，收集管底的裂解液即为全细胞蛋白提取液；所述制备APTES共价修饰后的硅胶中，用有特定蛋白高表达的细胞制备细胞膜层析柱，加入其抑制剂，使用ph7.0的磷酸盐缓冲液洗涤，以去除非特异性结合的杂质，随后采用ph3.3的磷酸盐缓冲液洗脱缓冲液，收集洗脱液，经浓缩后，高效液相检测；所述细胞膜和硅胶键合中，在真空涡旋的条件下，将细胞膜悬液和硅胶常温下混合反应5 rain，然后冰浴条件下搅拌50 rain，得到的细胞膜．硅胶混悬液，置于4℃冰箱中静置过夜；所述湿法装柱中，采用Waters996．515型液相泵，以PBS缓冲液为流动相将细胞膜．硅胶混悬液装填到细胞膜色谱柱芯中，梯度升速，0．5 min：0．2—1．0 mL／min，然后在O．2 mL／min流速下平衡30 rain，从而得到稳定的柱压；细胞膜色谱柱浸泡在PBS缓冲液中，4℃条件下保存备用。

2.根据权利要求1所述的一种高效筛选细菌感染特效药的细胞膜色谱柱制备方法，其特征在于，制备APTES共价修饰后的硅胶中，硅胶表面含有丰富的硅羟基(Si—OH)，先和(3．氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)反应后链接上了氨基，然后和戊二醛反应，链接上一个醛基；细胞膜是由丰富的磷脂构成的，因此含有大量氨基；键合了醛基的硅胶和细胞膜上氨基发生氨醛缩合反应，从而使硅胶和细胞膜以共价的方式结合。

3.根据权利要求1所述的一种高效筛选细菌感染特效药的细胞膜色谱柱制备方法，其特征在于，制备APTES共价修饰后的硅胶中，分为如下步骤，（1）精确称取1 g硅胶粉末，量取0．5 mLAPTES一起加入到50 mL甲苯体系中，在N2 保护下，油浴锅中恒温加热回流反应12h；（2）将混悬液收集并在12009×5 min室温条件下离心，弃上清，留沉淀；沉淀用HEPES 缓冲液(100 mM)清洗3次后80℃恒温烘干，得干燥粉末；（3）干燥粉末加入500 mL 5％戊二醛甲醇溶液常温搅拌2 h，此时溶液由白色变成砖红色；在1200Gx 5 min室温条件下离心，弃上清，留沉淀；沉淀用HEPES缓冲液清洗3次；（4）沉淀加入500 mL磷酸钠溶液(100 mM，pH=8)常温搅拌2 h，使反应后的基团展开，混悬液在12009×5 min室温条件下离心，弃上清，留沉淀。

4.沉淀用HEPES缓冲液清洗3次；（5）沉淀在80℃恒温条件下烘干，得干燥砖红色粉末即为APTES共价修饰后的硅胶。