[发明专利]一种YH66_10325基因改造的产L-异亮氨酸重组菌株及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种基于YH66_10325基因的产L‑异亮氨酸的重组菌株及其构建方法与应用。本发明通过对YH66_10325基因的敲除，发现该基因编码的产物对L‑异亮氨酸生产能力产生影响，通过在编码序列引入点突变，或者增加该基因的拷贝数或过表达获得重组菌株，所述点突变是使YH66_10325基因序列第925位碱基由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)，使编码的相应氨基酸序列第309位丙氨酸变为苏氨酸。所获得的菌株与未改造的菌株相比，有利于生产高浓度的L‑异亮氨酸。

技术领域

本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及一种YH66_10325基因改造的产L-异亮氨酸重组菌株及其构建方法与应用。

背景技术

L-异亮氨酸是人体八种必需氨基酸之一，同时又是三种支链氨基酸之一，因其特殊的结构和功能，在人类生命代谢中具有特别重要的地位。因此，已被广泛应用于食品、动物饲料和医药等行业。L-异亮氨酸的生产方法主要有蛋白质水解法、化学合成法和生物发酵法。生物发酵法因其原料成本低、易于控制、节能环保成为工业化生产的首选方法。目前，L-异亮氨酸的产量还不高，高产菌株的选育成为L-异亮氨酸产量提高的重要环节。

生产L-异亮氨酸的菌株主要是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)和大肠杆菌(Escherichia coli)。谷氨酸棒杆菌具有无内毒素、代谢同工酶少，有利于解除反馈抑制或转录衰减以及关键代谢酶抗反馈抑制能力强等特点，因此大多数研究者倾向于研究谷氨酸棒杆菌及其亚种，如谷氨酸棒杆菌(Brevibacterium flavum)和乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)等。优良菌种的选育依然是高产L-异亮氨酸的关键，随着高通量筛选技术的发展，结合传统诱变技术，有助于找到未知性状的高产L-异亮氨酸突变株。

虽然已筛选到一些可以提高L-异亮氨酸产量的菌株，但是为了满足日益增加的需求，仍需要找到更多高产L-异亮氨酸的突变株。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种多核苷酸及含有该多核苷酸的重组菌株,以及将重组菌株用于改善细菌的L-异亮氨酸生产能力。为了实现上述目的，本发明的发明人研究发现，具有L-异亮氨酸生产能力的谷氨酸棒杆菌ATCC15168基因组(GenBank：CP011309.1)中YH66_10325基因(GenBank：AKF27920.1)，可以通过修饰该基因或改善其表达，获得L-异亮氨酸产量提高的重组菌株，与未改造的野生型菌株相比，重组菌株的产L-异亮氨酸能力更强。

本发明采用如下技术方案实现：

本发明的第一方面，提供了生成L-异亮氨酸的细菌，其具有编码如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多核苷酸的改善的表达。根据本发明，所述改善的表达是所述多核苷酸表达增强，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变，或者编码SEQ IDNO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变且表达是增强的。

所述SEQ ID NO:3的氨基酸序列是基因YH66_10325编码的蛋白。

所述细菌与未修饰菌株相比具有增强的L-异亮氨酸生产能力。

在本发明中，术语“具有L-异亮氨酸生产能力的细菌”是指具有在培养基和/或细菌的细胞中以下述程度产生并累积目的L-异亮氨酸的能力，使得当细菌在培养基中培养时可以收集L-异亮氨酸的细菌。具有L-异亮氨酸生产能力的细菌可以是能够以比未修饰菌株可获得的量更大的量在培养基和/或细菌的细胞中积累目的L-异亮氨酸的细菌。

术语“未修饰菌株”是指尚未以使得具有特定特征的方式进行修饰的对照菌株。即，未修饰菌株的实例包括野生型菌株和亲本菌株。

在本发明中，除非另有说明，术语“L-异亮氨酸”是指游离形式的L-异亮氨酸、其盐或其混合物。