[发明专利]一种基于ddPCR检测CRISPR/Cas诱导的基因突变和基因编辑频率的方法

权利要求书

1.一种基于ddPCR检测CRISPR/Cas诱导的基因突变的方法，其特征在于，所述方法包括：

根据CRISPR/Cas靶序列的突变位置，设计一对变异位点特异性PCR扩增引物和变异位点特异性探针，以及一对内源参考基因特异性PCR扩增引物和内源参考基因特异性探针；

其中，所述变异位点特异性探针设置在突变位点区域，并且探针的5’端位于PAM区且连接有第一荧光基团，3’端连接有第一淬灭基团；所述内源参考基因特异性探针的5’端连接有第二荧光基团，3’端连接有第二淬灭基团，所述第一荧光基团和所述第二荧光基团不同。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

采用权利要求1的引物和探针进行ddPCR反应；

依据荧光微滴的荧光信号得出结果：第一荧光和第二荧光两种荧光信号均为阳性的微滴为野生型微滴，第二荧光信号阳性但第一荧光信号阴性的微滴为突变型微滴。

3.一种基于ddPCR检测CRISPR/Cas诱导的基因编辑频率的方法，其特征在于，所述方法在根据权利要求2所述的方法获得荧光微滴的荧光信号结果的基础上，计算突变型微滴拷贝数与野生型微滴拷贝数的比值来计算基因编辑突变频率。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述第一淬灭基团选自BHQ或MGB；所述第一荧光基团和所述第二荧光基团选自FAM、HEX和TEX中的任一种；优选地，所述第一荧光基团为FAM，所述第二荧光基团为HEX。

5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas靶序列为水稻TGW6基因的一段序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述变异位点特异性PCR扩增引物的上下游引物序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述变异位点特异性探针的序列如SEQ ID NO.3所示。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述内源参考基因特异性PCR扩增引物的上下游引物序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，所述内源参考基因特异性探针的序列如SEQ ID NO.6所示。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括提取植物模板DNA，然后将所述模板DNA与变异位点特异性PCR扩增引物和变异位点特异性探针以及内源参考基因特异性PCR扩增引物和内源参考基因特异性探针一起制备反应混合物，使用所述反应混合物进行ddPCR反应。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述ddPCR反应中，引物的浓度为400-600nM，优选地，引物的浓度为450-500nM；探针的浓度为200-400nM；优选地，探针的浓度为250-300nM。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述ddPCR反应的程序为93℃-96℃5-15min，93℃-95℃5-15s，55℃-60℃退火和延伸50-70s，35-40个循环，95-100℃下8-12min终止反应。