[发明专利]一种细胞冻存液和用于间充质干细胞的冷冻方法及其应用

说明书

本发明提供一种细胞冻存液，按体积百分数计，细胞冻存液包括以下组分：二甲基亚砜溶液1%～10%，羟乙基淀粉氯化钠溶液1%～10%，人血白蛋白溶液5%～20%，葡萄糖溶液2%～20%，右旋糖酐40氯化钠溶液5%～20%，非必须氨基酸溶液0.1～1%，剩余为Hank's平衡盐溶液，以上总和为100%。本发明的细胞冻存液组成成分简单、配制方便，多采用药用级辅料，能满足细胞治疗药品申报的要求，细胞冻存液冻存效果良好，冻存的细胞，复苏活率能稳定保持在90%以上，复苏后细胞的回收率90%以上，冻存效果良好，为细胞治疗的成药提供了保证。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种细胞冻存液及其用于间充质干细胞的冻存方法。

背景技术

干细胞由于具有自我更新和多向分化的潜能，已经被广泛应用于科学研究和临床治疗，干细胞中的间充质干细胞已经被广泛用于动物疾病模型的治疗研究和人体临床实验，间充质干细胞可治疗的疾病包括糖尿病、肝硬化、皮肤损伤、心肌梗死、干眼病以及神损伤等疾病，除此之外，间充质干细胞还具有促进造血和进行免疫调节等功能，目前在世界范围内已经有干细胞药物产品上市。

细胞冻存技术作为一种保存细胞的有效方法，在生物学领域已有深入广泛的应用，因为正常情况下，直接冷冻细胞会产生冰晶对细胞造成伤害，从而导致细胞死亡，因此在细胞冷冻保存时需要添加一定比例的冻存液，以保持冷冻复苏后细胞的完整性和最大限度减小对细胞的损伤，但不可避免的是，细胞在冷冻保存过程中会存在活性的降低和细胞损伤。

目前，关于细胞冻存液的专利技术很多，但各自有各自的技术特点，最常用的冻存液通常为胎牛血清(FBS)中添加10％二甲基亚砜(DMSO)溶液，DMSO可以减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性，可以很好地在细胞冻存过程中保护细胞，但使用FBS具有动物源病毒及细胞因子等造成安全隐患，不利于细胞制品规模化及产业化，从而限制了该技术的进一步提升。也有采用人血小板裂解液(HPL)替代传统的FBS成为无动物源的细胞冻存液，但这类细胞冻存液的长期冻存效果不佳，同时，不同批次的人血小板裂解液(HPL)有差异从而导致冻存细胞的质量不稳定。有的专利技术是基于可以直接用于人体输注，这类冻存液专利所使用的成分相对比较单一，一般是将少量的DMSO和白蛋白加入缓冲盐溶液，这类冻存液配方简单，但冻存效果不理想，活率很难稳定的保持在90％以上，回收率和贴壁率则更差，而且冻存过程要求比较苛刻，需要为其开发特定的冻存程序；有的专利技术为了提高冻存效果会加入一些小分子物质，如胰岛素、肝素、VEGF、HGF等，这些小分子的加入虽然有可能提高细胞冻存效果，但这些小分子类物质的加入增加了细胞应用于人体的风险，特别是激素类物质。因此，对于临床治疗的细胞需要开发冻存效果极佳的冻存液以及特定的冻存方法，以利用细胞制品的进一步产业化。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种细胞冻存液及其用于间充质干细胞的冻存方法，该冻存液组成成分简单，配制方便，冻存效果好，易于产业化制备，冻存液用于间充质干细胞的特定的冻存方法，冻存的细胞复苏活率能稳定保持在90％以上，复苏后细胞的回收率可达90％以上。

本发明采用的技术方案是：

一种细胞冻存液，其中，按体积百分数计，所述细胞冻存液包括以下组分：

二甲基亚砜溶液1％～10％，羟乙基淀粉氯化钠溶液1％～10％，人血白蛋白溶液5％～20％，葡萄糖溶液2％～20％，右旋糖酐40氯化钠溶液5％～20％，非必须氨基酸溶液0.1～1％，剩余为Hank's平衡盐溶液，以上总和为100％。

二甲基亚砜溶液中二甲基亚砜的质量浓度为＞99％，羟乙基淀粉氯化钠溶液中羟乙基淀粉的质量浓度为6％；人血白蛋白溶液中人血白蛋白的质量浓度为20％；葡萄糖溶液中葡萄糖的质量浓度为10％；右旋糖酐40氯化钠溶液中右旋糖酐40的质量浓度为6％，非必需氨基酸溶液浓度为100％。