[发明专利]一种含自体子宫内膜干细胞的生物美容面膜的制备方法

权利要求书

1.一种含自体子宫内膜干细胞的自体生物美容面膜的制备方法，其中，所述方法包括通过从自体经血中培养获取自体子宫内膜干细胞，并从自体外周血中得到富含血小板的血浆；取琼脂糖加入生理盐水后加热溶解，待温度降至40℃加入富含血小板的血浆，混匀后加入自体子宫内膜干细胞从而制备成生物美容面膜；其中，所述自体子宫内膜干细胞经流式细胞仪检测，高表达CD29+≥90％、CD44+≥90％和CD105+≥90％，低表达CD34+≤10％、CD45+≤10％和CD14+≤10％。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述面膜中还添加营养因子。

3.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于，所述自体子宫内膜干细胞由阴道采集经血，经血以磷酸盐缓冲液(PBS)等体积稀释，混匀。用1.077g/mL的淋巴细胞分层液，密度梯度离心法(1800r/min，25min)分离经血单个核细胞,小心吸取中间白膜层，加入2倍体积PBS缓冲液，1500r/min，10min洗涤2次，彻底弃去上清，加入1.0～2.0mL完全培养基吹打，混匀，计数，调整至适当细胞密度于37℃，5％CO 2培养箱中生长48小时。培养48小时后对子宫内膜干细胞换液，用5ml移液管吸弃培养液，加入含体积分数10％胎牛血清的α-MEM培养液，25cm2培养瓶继续放置37℃，5％CO 2培养箱中继续培养，间隔2天用新鲜培养液进行换液1次；子宫内膜干细胞在25cm2培养瓶中生长融合达到80％以上，用5ml移液管吸弃培养液，取5ml1×PBS洗涤一次培养瓶底，加入0.5ml、质量体积比为0.25％胰酶到培养瓶中，放置37℃，5％CO2培养箱中消化2-3分钟；消化后加入200μl胎牛血清终止消化，再加入5ml的生理盐水，用5ml移液管吹打，吸至15ml离心管中，再用5ml的生理盐水洗涤一次，加入到同一个15ml离心管中，1000转每分钟离心5分钟收集子宫内膜干细胞；离心后用1ml新鲜培养液重悬，计数，用5m l移液管加入10ml新鲜的含体积分数10％胎牛血清的α-MEM培养液，加入到1瓶75cm2培养瓶中继续在37℃，5％CO 2培养箱中生长，每隔2天换一次新鲜培养液；待子宫内膜干细胞生长融合达到80％以上时，按上述经胰酶消化收集子宫内膜干细胞，连续传代3代培养，获得4×107以上的子宫内膜干细胞，用4ml生理盐水重悬，苔盘兰染色计数，即获得子宫内膜干细胞，放置冰箱4℃存放备用；部分子宫内膜干细胞用40％子宫内膜干细胞培养液、10％二甲基亚砜和50％胎牛血清组成的冻存液，储存在-196℃液氮罐中，以备今后复苏后使用；取苔盼兰染色计数后的3×106子宫内膜干细胞，分三组，第一组分别添加到有20μE FITC标记鼠抗人CD29单抗、20μL PE标记鼠抗人CD44单抗和20μL Percp标记鼠抗人CD34单抗；第二组分别添加到有20μL FITC标记鼠抗人CD45单抗、20μL PE标记鼠抗人CD105单抗和20μL Percp标记鼠抗人CD14单抗；第三组为同型对照，分别添加到有20μLFITC标记鼠IgG1、20μL PE标记鼠IgG1和20μL PerCP标记鼠IgG1；置于4℃冰箱染色30分钟，然后用1mL的1×磷酸盐缓冲液洗涤三次，最后用0.5mL的1×PBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur临床型流式细胞仪检测；自体子宫内膜干细胞高表达CD29+≥90％、CD44+≥90％和CD105+≥90％，低表达CD34+≤10％、CD45+≤10％和CD14+≤10％。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述胰酶含质量体积比为0.01％的EDTA；所述PBS的pH值为7.4。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，自体血浆由抽取人50-100mlEDTA抗凝外周血，经1000转每分钟离心10分钟得到的10-80ml血浆，再次3000转每分钟离心10分钟获得10-80ml富含血小板血浆，放置4℃冰箱存放备用。